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>1. Überprüfung der Infektion
HINWEIS: Mit einem Zytotoxizitätstest kann die Infektionsfähigkeit gemessen werden. Das folgende Protokoll wird die Anwendung eines Zytotoxizitätsprodukts zur Messung der LDH-Freisetzung (Laktatdehydrogenase) hervorheben. Andere Zytotoxizitätsprodukte können ebenfalls verwendet werden
- Vorbereitung der C. neoformans-Infektion von Makrophagenzellen
- Aufbereitung von Pilzzellen
- Unter Verwendung eines Glycerinstamms den Wildtyp-C. neoformans-Stamm (H99) auf eine Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Agarplatte (YPD) streichen, um einzelne Kolonien zu isolieren.
Über - Nacht 16 Stunden bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie des Wildtyp-C. neoformans-Stammes aus und kultivieren Sie sie in 5 ml YPD-Bouillon in einem locker verschlossenen 10-ml-Reagenzglas. In vierfacher Ausführung durchführen.
Über - Nacht 16 Stunden bei 37 °C in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min inkubieren.
- Am folgenden Tag subkulturieren Sie jede Übernachtkultur in einer Verdünnung von 1:100 in 3 mL YPD-Brühe.
- Messen Sie die Werte der optischen Dichte (OD600 nm) von Pilzkulturen, um die mittlere logarithmische Phase zu bestimmen. Abhängig vom Spektralphotometer erreicht der Wildtyp-Stamm von C. neoformans die Mid-log-Phase, die üblicherweise nach einer 6- bis 8-stündigen Inkubation in YPD mit allgemeinen OD-Werten von600 nm zwischen 1,0 und 1,5 liegt.
- Sobald die Zellen die Mid-Log-Phase erreicht haben, nehmen Sie ein 10-μl-Aliquot der Pilzzellsuspension in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es 1:100 in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
- Sammeln und zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.500 x g für 10 Minuten, waschen Sie das Pellet vorsichtig mit sterilem PBS bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dies für insgesamt drei Wäschegänge.
- Resuspendieren Sie die Zellen in einem antibiotikafreien Zellkulturmedium, um eine Konzentration von 1,2 x 108 Zellen/ml zu erreichen.
- Aufbereitung von Makrophagenzellen
- Visualisieren Sie jede Vertiefung in der 6-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreicht haben. Alternativ können Zellen so vermessen werden, dass ca. 1,2 x 106 Makrophagenzellen pro Well erreicht werden.
Mit - Antibiotika angereichertes Medium vor der Zellkulturarbeit auf 37 °C erwärmen. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsumgebung vor der Zellkulturarbeit sterilisiert wird. Visualisieren Sie Zellen mit einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen adhärent und gesund sind.
- Nehmen Sie das Zellkulturmedium entweder mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumaspirator aus der Schale.
- Geben Sie vorsichtig 5-7 ml steriles PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) bei Raumtemperatur in die 60 x 15 mm große Schale.
- Kippen Sie das Geschirr vorsichtig, um anhaftende Zellen zu waschen.
- Co-Kultur von C. neoformans und Makrophagenzellen
- 1 ml der resuspendierten C. neoformans-Zellen in 4 Vertiefungen mit Makrophagenzellen geben.
Anmerkung: Die Anzahl der erforderlichen Platten muss vor Beginn des Experiments berechnet werden. Geben Sie 1 ml antibiotikafreies Medium in die leeren Vertiefungen.
- Die Zellen werden 3 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium entweder mit einer serologischen Pipette oder einem Vakuumaspirator von der Platte.
- Vorsichtig 1 ml steriles PBS bei Raumtemperatur hinzufügen.
- Kippen Sie die Platte vorsichtig, um nicht anhaftende oder nicht phagozytierte extrazelluläre C. neoformans-Zellen zu waschen.
- Geben Sie 1 ml antibiotikafreies Medium in jede Vertiefung in der 6-Well-Platte.
- Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Zu ausgewählten Zeitpunkten (z. B. 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden) ist der Überstand zur Messung der LDH-Freisetzung gemäß den Anweisungen des Herstellers zu sammeln.
- Gleichzeitig werden nicht infizierte Makrophagenzellen auf einen bestimmten Wert für maximale Zytotoxizität lysiert.
- Die Zytotoxizität wird wie folgt berechnet:
