Extraktion von Wirtszelllysat aus infizierten Wirtszellen, die in einem permeablen Membransystem kultiviert wurden

Zusammenfassung

Quelle: Flaherty, R. A., et al. Implementierung eines auf permeablen Membraneinsätzen basierenden Infektionssystems zur Untersuchung der Auswirkungen sekretierter bakterieller Toxine auf Säugetier-Wirtszellen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt ein durchlässiges Membraneinsatzsystem, um die Auswirkungen von bakteriellen Toxinen auf Wirtszellen auf kontrollierte und isolierte Weise zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die selektive Exposition der Zellen gegenüber den Toxinen bei gleichzeitiger Beibehaltung einer physikalischen Trennung, die die natürliche Wirt-Erreger-Interaktion nachahmt.

Protokoll

>1. Bakterienkultur

1. Erzeugung isogener Mutantenstämme, die für die Untersuchung des spezifischen sezernierten Faktors von Interesse verwendet werden sollen.
   Anmerkung: Zu den GASM1T1 5448 Streptokokkenstämmen, die für diese Experimente verwendet wurden, gehörten WT GAS', eine sagAΔcat SLS-defiziente Mutante (im Text als ΔsagA abgekürzt) und ein sagA komplementärer Stamm (im Text als ΔsagA+sagA abgekürzt).
2. Bereiten Sie über Nacht Flüssigkulturen mit Bakterienstämmen von Interesse vor. Züchten Sie GAS M1T1 5448-Stämme in -10 ml Todd-Hewitt-Brühe bei 37 °C für 16-20 Stunden, bevor Sie menschliche Zellen infizieren.
3. Bakterienkulturen über Nacht zentrifugieren (2.400 rcf für 10 min) und in frischem Bakterienmedium resuspendieren.
   Anmerkung: Die Resuspension im gleichen Volumen, in dem die Übernachtkulturen gezüchtet wurden (5-10 ml), führt im Allgemeinen zu einer wünschenswerten anfänglichen optischen Dichte.
4. Normalisieren Sie die Bakterienkulturen auf die gleichen Ausgangskonzentrationen, indem Sie die resuspendierten Kulturen in zusätzlichem Bakterienmedium verdünnen, bis für alle zu testenden Stämme die gleiche optische Dichte bei 600 nm (OD600) erreicht ist (der Einfachheit halber wird OD600 von ca. 1,0 empfohlen).
   Anmerkung: In diesen Studien wurden Bakterienkulturen in der stationären Phase verwendet, um Wirtszellen unmittelbar nach der Normalisierung zu infizieren. Da jedoch einige Bakterienstämme die stationäre Phase nicht synchron verlassen, kann es sinnvoller sein, Wirtsinfektionen mit Log-Phasenkulturen zu beginnen, wenn sich herausstellt, dass dies bei den interessierenden Stämmen der Fall ist.
5. Vor der weiteren Analyse ist ein Koloniezählassay durchzuführen, um die in den Ausgangskulturen vorhandenen koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Milliliter zu bestimmen, so dass die Multiplizität der Infektion (MOI) oder das Verhältnis von Bakterien pro Wirtszelle bestimmt werden kann.
   1. Bereiten Sie 1 ml serielle Verdünnungen von Bakterienkulturen vor, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder geeignetem Bakterienwachstumsmedium auf die gewünschte optische Dichte normiert wurden (in diesen Studien wurde Todd-Hewitt-Bouillon verwendet). Bereiten Sie Verdünnungen von ^10-1 bis 10-6 vor, um mindestens einen Satz Agarplatten mit zählbaren Kolonien (30-300 Kolonien) herzustellen. Führen Sie alle Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung durch.
   2. 100 μl jeder seriellen Verdünnung werden auf eine Agarplatte überführt, die das für die zu analysierende Bakterienart geeignete Medium enthält.
      Anmerkung: In diesen Studien wurde Todd-Hewitt-Agar verwendet.
   3. Verwenden Sie einen Bakterienstreuer aus Glas oder Kunststoff, um das 100 μl Aliquot gleichmäßig über die gesamte Oberfläche der Agarplatte zu verteilen, und verteilen Sie es weiter, bis die Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde. Unter Flamme mit einer sterilen Technik durchführen.
   4. Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37°C über Nacht oder bis zählbare Kolonien erscheinen.
   5. Zählen Sie die Kolonien, die auf jeder Platte wachsen, und berechnen Sie die KBE/ml in der Originalkultur nach folgender Formel: Anzahl der Kolonien x Kehrwert des in Millilitern plattierten seriellen Verdünnungs-/Kulturvolumens.
      z.B. (200 Kolonien x 1/^10-5 Verdünnung) / 0,1 ml plattiert = 2,0 x 10⁸ KBE/ml

>2. Wirtszellkultur

1. Beschaffen Sie sich eine geeignete Wirtszelllinie für die gewünschten Analysen.
   Anmerkung: Für diese Studien wurden humane epitheliale Keratinozyten29 HaCaT, ein freundliches Geschenk von V. Nizet, verwendet.
   1. Bewahren Sie HaCaT-Zellen in 100-mm-Kulturschalen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) auf. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂.

>3. Wirtszellinfektion mit permeablem Membraneinsatzsystem

1. Platten Sie die Zellen in geeignete Gewebekulturschalen und lassen Sie sie wachsen, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen.
   Hinweis: Die in diesen Studien verwendeten HaCaT-Zellen erreichen in der Regel innerhalb von 2-3 Tagen nach der Beschichtung die Konfluenz.
   1. Für die Lysatgewinnung (z. B. Signalanalyse und Adenosintriphosphat (ATP)-Bestimmungsassays) werden HaCaT-Zellen in 6-Well-Schalen mit einer Aussaatdichte von ca. 3 x 10⁵ Zellen/Well plattiert.
   2. Für Immunfluoreszenz-Bildgebungsexperimente werden Plattenzellen auf sterilen Glasdeckgläsern in 6-Well-Schalen mit einer Aussaatdichte von ca. 3 x 10⁵ Zellen/Well hergestellt.
   3. Für Assays zur Permeabilisierung von Ethidium-Homodimermembranen und zur Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) werden HaCaT-Zellen in 24-Well-Schalen mit einer Aussaatdichte von ca. 5 x 10⁴ Zellen/Well plattiert.
2. Unmittelbar vor der Behandlung die Zellen mit 1x sterilem PBS waschen.
3. Tragen Sie frisches Wachstumsmedium auf die Zellen auf. Unter den hier beschriebenen Bedingungen tragen Sie 2 ml Medium pro Vertiefung für 6-Well-Platten oder 0,5 ml Medium pro Vertiefung für 24-Well-Platten auf. Wenn pharmakologische Behandlungen getestet werden, mischen Sie es mit frischem Medium und tragen Sie es in diesem Schritt auf.
   Anmerkung: Für einige Assays sind möglicherweise alternative Medien erforderlich. Da beispielsweise Phenolrot und hohe Serumkonzentrationen den LDH-Freisetzungsassay beeinträchtigen, wurde für diese Experimente phenolrotfreies DMEM verwendet, das mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) (w/v), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat ergänzt wurde.
4. Nachdem frisches Medium aufgetragen wurde, legen Sie vorsichtig einen sterilen 0,4 μm durchlässigen Membraneinsatz in jede Vertiefung. Führen Sie diesen Schritt in einer Laminar-Flow-Haube durch und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den durchlässigen Membraneinsatz in jede Vertiefung zu übertragen.
5. Tragen Sie frisches Zellkulturmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die obere Kammer jeder Vertiefung auf. Unter den hier beschriebenen Bedingungen 1 ml Medium pro Vertiefung für 6-Well-Platten oder 0,1 ml Medium pro Vertiefung für 24-Well-Platten auftragen.
6. Tragen Sie ein angemessenes Volumen normalisierter Bakterienkulturen (siehe Abschnitt 1) auf die obere Kammer des permeablen Membraneinsatzsystems auf. Verwenden Sie ein bakterielles Medium für nicht infizierte Kontrollbehandlungen. Für die hier beschriebenen Ergebnisse fügen Sie 25 μl der normierten Kulturen pro Kammer für 24-Well-Platten und 100 μl der Kulturen pro Kammer für 6-Well-Platten hinzu.
   Hinweis: In diesen Studien wurde Wildtyp- oder mutiertes GAS bei einem MOI von 10 auf Wirtszellen aufgebracht. Der MOI wurde auf der Grundlage der endgültigen eukaryotischen Zellzahlen (z. B. 2 x 10⁶ Zellen/Well) berechnet, so dass zu Beginn der Infektionsperiode 10-mal so viele Bakterien pro Wirtszelle hinzugefügt wurden (z. B. 2 x 10⁷ KBE pro Well). Der geeignete MOI variiert je nach Bakterienart und mit den gewünschten Folgeanalysen.
   Anmerkung: Zusätzlich zur Verwendung von bakteriellem Medium für nicht infizierte Kontrollen können andere nützliche Kontrollen für bestimmte Anwendungen dieser Technik hitzeabgetötete Bakterien oder verbrauchtes bakterielles Medium zum Vergleich umfassen.
7. Inkubieren Sie infizierte Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂.

>4. Probenentnahme

1. Um Zellkulturmedium, Wirtszelllysate oder Glasdeckgläser mit intakten Zellen für Folgeanalysen zu sammeln, entfernen Sie zunächst vorsichtig den durchlässigen Membraneinsatz mit einer sterilen Pinzette.
2. Zur Beurteilung von Wirtszelllysaten:
   1. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig über der Monoschicht der Wirtszellen. Vermeiden Sie es, die Monoschicht zu stören, da dies zu Probenverlusten führen kann.
   2. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS.
   3. Saugen Sie PBS sanft an. Tragen Sie sofort eine angemessene Menge eiskalten Lysepuffers auf, um die gewünschte Proteinkonzentration zu erreichen, und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang auf Eis. Tragen Sie zwischen 200 μl und 350 μl Lysepuffer pro Vertiefung jeder 6-Well-Platte auf, um Proteinkonzentrationen zwischen 0,5 und 1,5 mg/ml zu erreichen.
      Hinweis: Der in diesen Studien verwendete Lysepuffer bestand aus deionisiertem Wasser, 1 % (v/v) Nonidet P40-Ersatz, einem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und einem Protease-Inhibitor-Cocktail. Spezifische Reagenzien sind im Abschnitt Materialien und Ausrüstung aufgeführt.
   4. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen von der Plattenoberfläche jedes Wells zu lösen, und pipettieren Sie den gesamten Inhalt jedes Wells in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 rcf für 20 min bei 4 °C.
   6. Um lösliche Lysatkomponenten zu beurteilen, entfernen Sie den Überstand eines frischen Röhrchens und lagern Sie es bei -20 °C oder verwenden Sie es sofort.
   7. Um nukleare oder andere unlösliche Lysatbestandteile zu beurteilen, reservieren Sie das Pellet und lagern Sie es bei -20 °C oder verwenden Sie es sofort.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HaCaT humane epitheliale Keratinozyten			Geschenk aus dem Labor von Victor Nizet.
Dulbecco's Modifizierter Adler Medium (DMEM)	Lebenstechnologien	Nr. 11995-073	Verwenden Sie ein geeignetes Medium für die gewünschte Zelllinie.
Fötales Rinderserum (FBS)	Biowest (Biowesten)	Nr. S162H	Verwenden Sie geeignete Medienadditive für die gewünschte Zelllinie.
10 cm Gewebekulturschalen	Nunc	Artikel-Nr.: 150350	Andere Marken sind geeignet.
6-Well-Gewebekulturschalen	CytoOne	CC7682-7506	Andere Marken sind geeignet, müssen aber mit dem Corning-Einsatz kompatibel sein.
Kollagenbeschichtete 0,4 μm Transwell-Einsätze (6 Wells)	Corning	Artikel-Nr.: 3540
Kollagenbeschichtete 0,4 μm Transwell-Einsätze (24 Well)	Corning	3595
Zell-Abstreifer	Fisherbrand	Tel.: 08-100-241	Diese werden nur für die Entnahme von Zelllysaten benötigt.
Nonidet P40 Stellvertreter	Sigma	74385-1L	Andere Lieferanten sind geeignet.

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