Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen mittels Fluoreszenzbildgebung

Abstract

Quelle: Yang, J., et al. Automatisierter Hochdurchsatznachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert den bakteriellen Adhärenz-Assay zur Bewertung der GFP-markierten bakteriellen Adhärenz an epithelialen Zellkulturen, um die Dynamik von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung zu untersuchen.

Protocol

>1. Bakterielle Adhärenz und Wirtszellfärbung

1. Waschen Sie zunächst die ausgesäten A549-Zell-Monolayer dreimal mit warmem 1x PBS. Geben Sie bei jeder Wäsche 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung, pipettieren Sie dreimal vorsichtig auf und ab, entsorgen Sie 1x PBS oder warten Sie 10 s nach der Zugabe und vakuumieren Sie dann, um 1x PBS zu entfernen. Um die Kinetik der bakteriellen Assoziation zu bestimmen, überlagern Sie die Zellen mit 100 μl der gewünschten Konzentrationen der bakteriellen Suspension mit unterschiedlichen MOIs (0, 1, 10 und 100). Schleudern Sie die Bakterien bei 200 x g für 10 min herunter und inkubieren Sie die infizierten A549-Zellen bei 37 °C, 5% CO₂ für weitere 1 h.
   Anmerkung: In diesem Experiment hatte jede Bedingung ein technisches Triple.
2. Entfernen Sie die ungebundenen Bakterien, indem Sie die Monolagen wie oben beschrieben fünfmal mit warmem 1x PBS waschen. Geben Sie 100 μl 4 % Formaldehyd (in 1x PBS) in jede Vertiefung der 96-Well-Platten, um die Zellen zu fixieren. Lassen Sie die Platten 15 min auf Eis ziehen und waschen Sie dann die Fixierlösung dreimal mit 1x PBS ab.
3. Um die Zellkerne zu färben, fügen Sie 50 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei RT. Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation dreimal mit 1x PBS. Bedecken Sie die infizierten A549-Zellen mit 100 μl 1x PBS, um ein Austrocknen zu vermeiden. Für den nächsten Schritt verarbeiten oder die Platte bei 4 °C bis zu 2 Tage im Dunkeln lagern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	VWR	Nr. 45001-130
4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Thermo Fischer	Artikel-Nr.: 62248	Farbstoff zur Färbung von Wirtszellen
96-Well-Platte	Corning	3882	Halbe Fläche gut, flacher, klarer Boden
A549-Zellen	ATCC	CCL 185	Säugetier-Zelllinie
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
Typische Sojabrühe	Wachstumszellen	MBPE-4040
F-12k mittel	ATCC	302004	A549 Zellkulturmedium
Fötales Rinderserum	Corning	35-016-CV