Ein bildgebendes Verfahren zur Untersuchung der Kalziumreaktion in bakterieninfizierten Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Smail, Y., et al. Bildgebung von Ca2⁺-Reaktionen während der Shigella-Infektion von Epithelzellen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine Technik zum Nachweis der lokalen und globalen Kalziumionenreaktion bei einer Shigelleninfektion von menschlichen Epithelzellen. Shigella dringt in die Wirtszellen ein und setzt Invasionseffektoren frei, die sich auf den intrazellulären Kalziumspiegel auswirken. Die Amplitude und Frequenz des lokalen und globalen zytosolischen Calciums werden mit Hilfe eines Fluoreszenzindikators untersucht.

Protokoll

>1. Vorbereitungen

1. Vorbereitung von Bakterien
   1. Die Bakterien – Shigella-Wildtyp-Stamm, der das AfaE-Adhesin (M90T-AfaE) exprimiert – werden auf eine Trypticase-Soja-Agarplatte (TCS) mit 0,01 % Kongorot (CR) aufgetragen und 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert><. Anmerkung: Um ihre Reproduzierbarkeit zu erhöhen, werden die in Schritt 1.1.1 erhaltenen Shigella-Platten bei 4 °C gelagert und sollten innerhalb einer Woche verwendet werden, da sich alle Kolonien auf CR-Medium mit der Zeit rot verfärben.
   2. Beimpfen Sie die TCS-Bouillon-Vorkultur, indem Sie 3 rote Kolonien aus den Streifenplatten auswählen.
      Anmerkung: Eine Inokulation mit 3 Kolonien wird durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit zu begrenzen, dass ein einzelner Klon ausgewählt wird, dessen Virulenzplasmid eine genetische Rekombination durchlaufen hat.
   3. Züchten Sie flüssige Bakterienkulturen in einem Schüttelinkubator für 16 Stunden bei 37 °C bei 200 U/min. Fügen Sie Ampicillin in einer Endkonzentration von 75 mg/ml hinzu. Die Antibiotikakonzentrationen sollten das 3-fache der minimalen Hemmkonzentration nicht überschreiten, da ein Überschuss an Antibiotika zum Verlust des großen Virulenzplasmids führen kann.
      Anmerkung: Die Aufrechterhaltung des Shigella-Virulenzplasmids sollte durch Plattieren der Bakterienkulturen auf CR-Platten überprüft werden, die mit geeigneten Antibiotikakonzentrationen ergänzt werden. Das Vorhandensein von weißen Kolonien deutet auf einen Plasmidverlust hin.
   4. Beimpfen Sie die TCS-Kultur mit der bakteriellen Vorkultur in einer Verdünnung von 1:100. Inkubieren Sie es bei 37 °C in einem Schüttelinkubator für 2 h bei 200 U/min. Stellen Sie sicher, dass die optische Dichte bei 600 nm (OD_{600 nm}) 0,2 - 0,4 beträgt.
   5. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur 2 Minuten lang bei 13.000 x g bei 21 °C und resuspendieren Sie das Pellet in einem äquivalenten Volumen EM-Medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM Glukose und 25 mM HEPES, pH = 7,3).
   6. Verdünnen Sie die bakterielle Suspension in einem EM-Puffer bei einem End-OD_{von 600 nm} von 0,1 und verwenden Sie sie sofort oder lagern Sie sie bei 21 °C und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten 60 Minuten.
2. Vorbereitung der Zellen
   1. Züchten Sie HeLa-Zellen in DMEM mit 1 g/l Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), und züchten Sie sie bei 37 °C mit 10 % CO₂. Züchten Sie TC-7 in DMEM mit 4,5 g/l Glukose, das 10 % FCS und nicht-essentielle Aminosäuren enthält, in einem 37 °C-Inkubator mit 10 % CO₂.
   2. Zur Zellerhaltung sollten die Zellen regelmäßig geteilt werden, um eine Wachstumskontakthemmung zu vermeiden, die mit konfluenten Zuständen verbunden ist; dies ist entscheidend für eine hohe Effizienz der Ca2⁺-Sondenbelastung/Transfektion.
   3. HeLa-Zellen am Tag vor dem Experiment für die HeLa-Zellen auf sterile kreisförmige Deckgläser mit einem Durchmesser von 25 mm in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 10⁵ Zellen/Well aufplädieren.
   4. Für TC-7-Zellen trypsinisieren und zählen Sie die Zellen. Aussaat in 4 x 10⁵ Zellen/Vertiefung und Inkubation für 5 - 7 Tage bei 37 °C in einem 10%igen CO₂ -Inkubator vor den Experimenten, um eine Polarisation zu ermöglichen.
      1. Aktualisieren Sie das Zellkulturmedium täglich bis zum Tag des Experiments.
         Anmerkung: Einwegkammern mit Glasboden und einem Durchmesser von 35 mm können auch als Alternative zu den Deckgläsern verwendet werden. Werden letztere verwendet, ist eine Temperierung durch einen beheizten Tisch oder ein beheiztes Objektiv nicht ausreichend, und es ist eine auf dem Mikroskoptisch montierte Thermostat-Inkubationskammer erforderlich.
3. Am Tag des Experiments das Medium entfernen und die Zellen 3x mit 1 mL EM-Medium bei 21 °C waschen.
4. Laden Sie die Zellen mit 3 mM Fluo-4/Acetoxymethylester (Fluo-4-AM) in einen EM-Puffer für 30 min bei 21 °C.
   Anmerkung: Während die Beladung von subkonfluenten HeLa-Zellen keine größeren Probleme aufwirft, ist die Beladung von polarisierten TC-7-Zellen oft heterogen und wenig effizient. Für diese Zellen fanden wir, dass die Beladungseffizienz durch die Zugabe des Dispergiermittels – Pluronsäure – in einer Endkonzentration von 0,1% und des Anionentransporter-Inhibitors Bromosulfophtalein in einer Endkonzentration von 20 μM zum Fluo-4-AM-haltigen EM erhöht wird. Die Verwendung von ratiometrischen chemischen Sonden oder genetisch kodierten FRET-Sonden, die eine duale Erfassung erfordern, ist nicht mit der Erfassungsgeschwindigkeit kompatibel, die für die Abbildung lokaler Ca2⁺-Reaktionen erforderlich ist.
5. Waschen Sie die Proben 3x mit EM-Puffer und inkubieren Sie sie weiter in 1 mL EM-Puffer bei 21 °C, um die Hydrolyse des AM-Anteils zu ermöglichen. Mit Fluo-4 beladene Zellen sofort oder innerhalb der nächsten 90 Minuten (bei 21 °C gehalten) verwenden.

>2. Infektion und Bildaufnahme von lokalen Ca²⁺-Reaktionen

1. Legen Sie das Deckglas mit den mit Fluo-4 beladenen Zellen in eine Bildgebungskammer oder eine Glasbodenkammer. Waschen Sie die Proben in der Bildgebungskammer oder der Einwegkammer mit Glasboden 3x mit EM-Puffer, um Verbindungen zu entfernen, die möglicherweise aus der Zelllyse resultieren. Fügen Sie 1 ml EM-Puffer hinzu.
2. Stellen Sie die Kammer auf einen inversen Fluoreszenzmikroskoptisch, der auf 33 °C erhitzt wird.
   Anmerkung: Diese Temperatur wird als Kompromiss zwischen den optimalen Temperaturen, die mit dem Shigella-Invasionsprozess kompatibel sind, und der Verlangsamung der Ca2⁺-Reaktionen gewählt, um die lokalen Reaktionen zu visualisieren. Wir verwenden ein 63X Immersionsöl-Objektiv (NA = 1,25), das mit Phasenkontrastringen ausgestattet ist.
3. Wählen Sie ein Mikroskopiefeld aus und richten Sie die Erfassungsparameter ein, einschließlich Belichtungszeit und Binning, falls erforderlich, um das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 zu optimieren.
   Anmerkung: Die größten Herausforderungen bei der lokalen Ca2⁺-Bildgebung sind die geringe Amplitude und die geringe Dauer der Reaktionen, die eine Erfassung mindestens alle 30 ms erfordern. Mehrere kommerziell erhältliche rückwärtig belichtete elektronenvermehrende ladungsgekoppelte Bauelemente (EM-CCD) oder komplementäre Metalloxid-Halbleiter (C-MOS) Kameras bieten die erforderliche Empfindlichkeit, um lokale Ca2⁺-Reaktionen mit Fluo-4 zu detektieren. Die Nachweisempfindlichkeit ist auch ein wichtiges Thema bei der Begrenzung von Lichtschäden oder Artefakten wie spontanen Reaktionen, die mit der fluoreszierenden Anregung von Fluo-4 bei hoher Frequenz verbunden sind. Hier wurde eine LED-basierte Beleuchtung von 470 nm mit einem 480 ± 40 nm Bandpassanregungsfilter, einem dichroitischen 505-nm-Filter und einer 527 ± 30 nm Bandpassemission verwendet, die bei 5 % ihrer maximalen Intensität verwendet wurde, kombiniert mit einem 1,0-Neutraldichtefilter, um diese Probleme bei einem Strom von Erfassungen von begrenzter Dauer zu minimieren. Eine Analyse der lokalen^Ca2+-Signale durch Chargen von 120 s-Strömen wurde routinemäßig durchgeführt. Unter diesen Bedingungen bei geringer Beleuchtung wurde während der 2-Minuten-Stream-Aufnahmen kein Fluorophor-Photobleaching beobachtet. Aufeinanderfolgende Erfassungen an derselben Probe können durchgeführt werden, sofern unterschiedliche Felder verwendet werden. In der Regel wird ein erster Akquisitionsstrom auf einem Kontrollfeld ohne Bakterienstimulation durchgeführt, um sicherzustellen, dass keine spontanen Reaktionen auftreten. Wenn spontane Reaktionen beobachtet werden, werden die Proben mit EM-Puffer gewaschen, bis keine Reaktionen mehr beobachtet werden.
4. Um der Probe Bakterien hinzuzufügen, nehmen Sie 500 μl EM-Puffer aus der Kammer und fügen Sie 500 μl der in Schritt 1.1.6 hergestellten Bakteriensuspension hinzu, um einen endgültigen OD_{600 nm} von 0,05 zu erhalten, wobei Sie entsprechend darauf achten sollten, dass das ausgewählte Mikroskopiefeld nicht verschoben wird; die Volumina gewährleisten eine ordnungsgemäße Durchmischung der Bakterien und eine homogene Verteilung der Bakterien auf den Zellproben.
5. Führen Sie eine Akquisition nach der bakteriellen Zugabe durch. Alternativ kann 10 Minuten nach der Bakterienzugabe eine Erfassung durchgeführt werden, was der Zeit entspricht, die die Bakterien benötigen, um sich unter den verwendeten Bedingungen auf den Zellen zu sedimentieren. Am Ende des Erfassungsstroms wird ein Phasenkontrastbild des ausgewählten Feldes aufgenommen, um die Bakterien, die mit den Zellen in Kontakt kommen, und die Membrankräuselungen, die mit den bakteriellen Invasionsstellen verbunden sind, zu visualisieren.
6. Wiederholen Sie den Aufnahmevorgang wie in Schritt 2.5 in Abständen, die der Dauer der Bildaufnahmen, der Dateispeicherung und der Auswahl eines neuen Feldes zur Abdeckung des gesamten Prozesses entsprechen.
   Hinweis: Bei Shigella stellten wir fest, dass die Akquisitionsströme alle 5 Minuten für 20 Minuten, nach der 10-minütigen bakteriellen Sedimentation, den Großteil der Invasionsereignisse abdecken konnten.
7. Am Ende des Erfassungsvorgangs wird eine Endkonzentration von 2 μM der Ca2⁺-Ionophor-Ionomycin-Proben hinzugefügt, um die maximale Amplitude der Ca2⁺-Signale zu bestimmen. Nehmen Sie alle 3 - 5 s Bilder auf, bis das Signal stabilisiert ist, in der Regel für weniger als 10 Minuten.
8. Anschließend wird Ca2⁺-Chelator Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N, N, N′, N′-Tetraessigsäure (EGTA) in einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, um das Fluoreszenzsignal in Abwesenheit von Ca2⁺ zu bestimmen. Erfassen Sie Bilder alle 3 - 5 s bis zur Signalstabilisierung, in der Regel für weniger als 10 min.
   Anmerkung: Aufgrund der relativ langsamen Dynamik der globalen Ca2⁺-Variationen sollten diese Aufnahmen alle 3 - 5 s (nicht im Streaming-Modus) durchgeführt werden, um eine Ca2⁺-Bildgebung auf demselben mikroskopischen Feld während der aufeinanderfolgenden Behandlungen zu ermöglichen.

>3. Analyse

1. Exprimieren Sie zytosolische Ca2⁺-Variationen über die Zeit als Prozentsatz von ΔF/F0, wobei ΔF die Variation der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der interessierenden Region (ROI) und F0 die Basisfluoreszenz in derselben ROI darstellt, zu der ein nicht relevanter Bereich des Feldes ohne Zellen subtrahiert wird.
   1. Entfernt man die basalen Fluoreszenzwerte für jede Zelle in verschiedenen Feldern, die den Ausgangswerten entsprechen; diese Werte können aufgrund der geringen Häufigkeit und der relativ kurzen Dauer der lokalen Ca2⁺-Reaktionen in einer gegebenen Stromaufnahme eindeutig bestimmt werden.
      Hinweis: Quantifizieren Sie auffällige Merkmale der Antworten in Bezug auf die gestellten Fragen und das untersuchte pathogene Modell. Klassischerweise werden bei der Analyse von Ca2⁺-Signalen verschiedene Parameter berücksichtigt, darunter die Häufigkeit von Zellen, die lokale oder globale Ca2⁺-Antworten zeigen, sowie die Dauer, Amplitude und Häufigkeit dieser Reaktionen. Im Fall von Shigellen und lokalen Reaktionen ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Analyse die räumliche Assoziation der Reaktionen mit bakteriellen Invasionsstellen.
2. Um den Prozentsatz der responsiven Zellen zu quantifizieren, die globale oder lokale Reaktionen zeigen, zeichnen Sie ROIs in Zellen in Zeitreihen, die den Variationen der Fluo-4-Intensität entsprechen.
   1. Legen Sie strenge Parameter fest, um lokale Ca2⁺-Reaktionen zu identifizieren, wie z. B. eine Amplitude von dreifach über den Hintergrundvariationen der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Zelle oder eine Dauer von mindestens 200 ms, um ein falsch positives Ergebnis zu vermeiden.
      Anmerkung: In der Regel lassen sich auch kleine lokale Ca2⁺-Antworten anhand ihres Profils von jeglichem Hintergrundrauschen unterscheiden. Die ROIs sollten groß genug sein, um genügend Fluoreszenzsignale zu integrieren, um lokale Variationen nachweisen zu können. Abhängig von der Intensität der Fluo-4-Detektion können diese ROIs Kreisen mit Durchmessern von 2 - 5 mM entsprechen.
   2. Messen Sie die Schwankungen der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität von Fluo-4 in 2 Regionen in einem bestimmten Bereich derselben Zelle, um festzustellen, ob die Reaktionen lokal oder global sind.
      Anmerkung: Die Analyse einer großen Anzahl von Zellen wird durch den Einsatz von Bildgebungssoftware erleichtert, die die Online-Bildschirmdarstellung der Schwankungen der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität über die Zeit für die ausgewählten Regionen ermöglicht. Kommerziell erhältliche Bildgebungssoftware verfügt über eine solche Option, aber dies kann auch mit der Freeware Icy unter Verwendung des ROI Intensity Evolution-Plugins durchgeführt werden.
   3. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die lokale Reaktionen zeigen.
      Anmerkung: Dieser Prozentsatz wird aus der Gesamtzahl der im Mikroskopiebereich analysierten Zellen berechnet, die in ausreichender Anzahl sein sollten, um eine statistische Signifikanz mit einem nicht-parametrischen Test zu unterstützen.
   4. Bestimmen Sie die Dauer der lokalen Antworten.
      Anmerkung: Lokale Ca2⁺-Reaktionen können weiter nach ihren Dauerbereichen (d.h. weniger als 500 ms, zwischen 5 und 10 s oder über 10 s) und ihrer Assoziation mit Shigella-Invasionsstellen unterschieden werden.
3. Quantifizieren Sie die Amplitude der Antworten. Kalibrieren Sie zunächst die in Schritt 2.1.7 ermittelten maximalen Ca²⁺- und Zellhintergrundwerte. Da die Fluo-4-Belastung für jede Zelle variieren kann, führen Sie diese Bestimmungen für einzelne Zellen im Feld durch.
   1. Drücken Sie die Amplitude der Antwortvariablen als relativen Prozentsatz der maximalen Antwortvariablen aus.
   2. Führen Sie statistische Tests mit einem Normalitätstest durch, gefolgt von einem parametrischen Test, um potenzielle Unterschiede in der Amplitude der Antworten zwischen den Stichproben zu analysieren.
   3. Bestimmen Sie die Assoziation dieser Reaktionen relativ zu den bakteriellen Invasionsstellen durch ihre jeweilige Lokalisation zu den bakteriell induzierten Membrankräuseln, die in den entsprechenden Phasenkontrastbildern sichtbar sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fluo-4 AM	Invitrogen	Nr. F14201
Metamorph Version 7.7	Universelle Bildgebung
CoolLED-Beleuchtungssystem pE-2	Roper Scientific
Mikroschale 35 mm, hoch	EBD.	Artikel-Nr.: 81156
Trypticase Soja (TCS) Brühe	Thermofischer	Nr. B11768
TCS-Agar	Thermofischer	Nr. B11043
Kongo-Rot	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017		Shigella flexneri Serotyp V., der das AfaE-Adhäsin exprimiert
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		Isogener ipgD-Mutantenstamm, der das AfaE-Adhäsin exprimiert