Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Präparation von Pan-Leukozyten
- Entnehmen Sie 1 ml peripheres Blut von einem gesunden Spender (oder Patienten) in einer heparinisierten Spritze. Stellen Sie sicher, dass Sie die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission für die Blutspende haben.
- Mischen Sie 1 ml humanes peripheres Blut mit 30 ml ACK-Lysepuffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 und 0,1 mM EDTA, pH 7,0) in einem 50 ml-Röhrchen und inkubieren Sie es 8 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie die Röhrchen mit PBS und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 6 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 30 mL ACK-Lysepuffer
.
- Die Schritte 1.2 und 1.3 wiederholen, bis der Überstand frei ist. Zum Schluss waschen Sie die Zellen in PBS, zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 6 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 mL Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 60 min.
>2. Laden von Raji-Zellen mit SEB
- Bereiten Sie zwei 15 mL Falcon Röhrchen mit 1,5 x 106 Raji Zellen pro Röhrchen vor. Schleudern Sie die Zellen herunter (300 x g für 6 min bei Raumtemperatur) und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellen in Restmedium (ca. 50–100 μl), fügen Sie 1,9 μl (1,9 μG) SEB hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 5 mL Kulturmedium hinzu, schleudern Sie die Zellen herunter (300 x g für 6 Minuten bei Raumtemperatur) und resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS) bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml.
>3. Induktion von Immunsynapsen und Färbeprotokoll
- 500 μl der Präparation von SEB-beladenen Raji-Zellen in ein FACS-Röhrchen und 500 μl der Präparation von ungeladenen Raji-Zellen in ein anderes FACS-Röhrchen pipettieren. Geben Sie 650 μl Pan-Leukozyten in jedes Röhrchen und schleudern Sie die Zellen herunter (300 x g für 10 min bei Raumtemperatur). Den Überstand verwerfen und das Pellet in 150 μl Kulturmedium (RPMI1640 + 10 % FCS) resuspendieren. Inkubieren Sie bei 37 °C (typischerweise 45 min).
- Drehen Sie die Zellen vorsichtig vor (10 s bei 1.000 U/min) und fügen Sie während des Vortex 1,5 ml Paraformaldehyd (1,5%) hinzu, um die Zellen zu fixieren. Stoppen Sie die Fixierung, indem Sie 1 ml PBS + 1% BSA hinzufügen. Pelletieren Sie die Zellen (300 x g für 10 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL PBS + 1 % BSA, nachdem Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben.
- Pelletieren (300 x g für 10 min bei Raumtemperatur) und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin für 15 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren (96-Well-Platte, U-förmig).
- Waschen Sie die Zellen in PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin mit Zentrifugation (300 x g für 10 min bei Raumtemperatur) und resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μl PBS + 1 % BSA + 0,1 % Saponin, das Fluorophor-markierte Antikörper oder Verbindungen enthält (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) und DAPI (1:3.000)).
- Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen 3 Mal, indem Sie 1 ml PBS + 1% BSA + 0,1% Saponin hinzufügen. Bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 60 μl PBS für die Bildgebung der Durchflusszytometrie
.
>4. Bildaufnahme mit einem Durchflusszytometer
HINWEIS: Das folgende Bildaufnahmeverfahren und die Datenanalyse basieren auf bildgebender Durchflusszytometrie mit Software wie imagestream (IS100), INSPIRE und IDEAS. Es können aber auch andere Durchflusszytometer und Analysesoftware verwendet werden.
- Öffnen Sie die Analysesoftware auf dem Computer, der mit dem bildgebenden Durchflusszytometer verbunden ist, und klicken Sie im Instrumentenmenü auf Initialize Fluidics. Bringen Sie die Perlen an der rechten Stelle an, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
- Laden Sie die Standardvorlage aus dem Menü Datei und klicken Sie auf Ausführen/Setup. Wählen Sie Perlen aus dem Dropdown-Menü Ansicht aus.
- Stellen Sie die Hellfeldbeleuchtung ein, indem Sie auf Intensität einstellen klicken, wenn der angezeigte Wert unter 200 liegt.
- Führen Sie die Kalibrierungs- und Testroutine auf der Registerkarte Assist aus, indem Sie auf Alle starten klicken.
- Klicken Sie auf Flush/Lock/Load und wenden Sie die Samples im linken Port an, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Nachdem Sie die Zellen in das Durchflusszytometer geladen haben, öffnen Sie den Zellklassifikator und stellen Sie die Werte wie folgt ein: Obergrenze für die Spitzenintensität bei 1.022 für jeden Kanal, untere Grenze für die Spitzenintensität bei 50 für Kanal 2 (DAPI) und Kanal 5 (CD3-Pe-TxR), untere Bereichsgrenze bei 50 für Kanal 1 (Seitenstreuung) und obere Grenze bei 1.500.
- Ändern Sie die Leistung des Anregungslasers auf der Registerkarte "Setup" auf 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) und 647 nm (90 mW).
- Wechseln Sie im Dropdown-Menü Ansicht zwischen Zellen und Perlen, um den Zellklassifikator und die Laserleistungsanpassungen auszuwerten.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen und Zellpaare in der Zellansicht gefunden werden und dass Zellklumpen, Ablagerungen und Bilder mit gesättigten Pixeln in der Partikelansicht gefunden werden, indem Sie die Zellklassifikatoren und/oder die Anregungslaserleistungen ändern.
- Definieren Sie den Namen des Samples und die Anzahl der aufzunehmenden Bilder (15.000–25.000 für Samples und 500 für Kompensationssteuerungen) auf der Registerkarte Setup. Klicken Sie auf Run/Setup, um die Aufnahme zu starten.
