HINWEIS: Alle Techniken zur Herstellung des Mediums und zur Zellkultur werden unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung einer Biosicherheitswerkbank mit laminarer Strömung durchgeführt. Alle beschriebenen Kulturinkubationsschritte werden mit einem Inkubator durchgeführt, der für eine Atmosphäre von 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit ausgelegt ist.
>1. Zellkultur
- Vorbereitung des Nährmediums
- Für MSC (mesenchymale Stammzellen) und LADMAC (aus dem Knochenmark der Maus gewonnene Makrophagen; es leitet sich von den Namen der Forscher ab, die die Zelllinie etabliert haben: Laskin, Dower und Malech) fügen Sie 50 ml FBS und 5 ml 100x Antibiotika/Antimykotika-Mischung zu 500 ml hochglukosereichem DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) hinzu.
- Für die Makrophagen (MΦ) werden 50 ml FBS, 100 ml LADMAC-Medium (gemäß den Schritten in Abschnitt 1.2 hergestellt) und 5 ml 100-facher Antibiotika-Mix zu 500 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt hinzugefügt.
Anmerkung: LADMAC-Zellen produzieren den koloniestimulierenden Faktor (CSF-1), der zur Unterstützung des Wachstums der MΦ-Zellen notwendig ist.
- Vermehrung von Zellen zur Vorbereitung auf die Co-Kultur
- Um MSC- und MΦ-Zellen aus dem gefrorenen Bestand zu säen, werden 9 ml des in Abschnitt 1.1 vorbereiteten geeigneten Wachstumsmediums in jeder der vier mit 100 mm Zellkulturen behandelten Schalen für jeden Zelltyp äquilibriert und für 15 Minuten in den Zellkulturinkubator gestellt.
- In der Zwischenzeit die Aliquots von 10bis 6 gefrorenen Zellen schnell auftauen, indem Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2-3 Minuten inkubieren oder bis sie gerade aufgetaut sind. Geben Sie dann die aufgetauten MSC-Zellen zu 9 mL frischem MSC-Wachstumsmedium und fügen Sie die aufgetauten MΦ-Zellen zu 9 mL frischem MΦ-Wachstumsmedium in sterilen konischen 15- oder 50-ml-Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie es bei 125 x g in einem schwingenden Schaufelrotor für 5 Minuten.
- Aspirieren oder dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 4 ml des entsprechenden frischen Wachstumsmediums, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Für jeden Zelltyp, die in Schritt 1.2.1 äquilibriert wurden, wird jeweils 1 ml der Zellsuspension in eine der vier 100-mm-Schalen gegeben.
- Stellen Sie die Schalen mit den Zellen wieder in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage, bis 70%-80% konfluent sind.
>2. Saatgut-MSC in experimentellen Schalen, Tag 1
HINWEIS: Entwerfen Sie vor dem Seeding des MSC das experimentelle 96-Well-Plattenlayout für die Fluoreszenzspektrophotometrie und den Kammerschieber für die dynamische Bildgebung. Für die 96-Well-Platte flankieren Sie die experimentellen Wells mit Wells, die Zellen enthalten, aber verwenden Sie diese nicht im Assay. Markieren Sie mindestens vier Vertiefungen, die für den Reagenzblindwert (RBL) verwendet werden sollen. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für eine 96-Well-Vorlage und in Tabelle 2 ein Beispiel für eine 4-Well-Kammer-Objektträgervorlage. Empfohlen werden schwarze oder weiße 96-Well-Platten mit klarem Boden. Optimal ist ein 1,5 mm großer Kammerobjektträger aus Borosilikatglas, aber die Anzahl der Kammern kann je nach Studiendesign angepasst werden. Ein zusammenfassendes Flussdiagramm der folgenden Methoden ist in Abbildung 1 enthalten.
- Bei einer Konfluenz von 70 % bis 80 % aspirieren Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturen in 100-mm-Schalen und fügen Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um die MSC zu isolieren.
- Aspirieren Sie das PBS, fügen Sie 2 ml 0,05 % Trypsin/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) hinzu und legen Sie es für 3-5 Minuten in den Kulturinkubator.
- Nach 3 min die Zellablösung mit einem inversen Mikroskop überprüfen. Wenn die Zellen abgelöst sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, setzen Sie die Inkubation für weitere 1-2 Minuten fort. Nicht länger als 5-6 min inkubieren.
- Geben Sie 5 ml frisches Wachstumsmedium mit den abgelösten Zellen in die Schale. Spülen Sie das Gericht mit der Trypsin-Medium-Mischung aus und sammeln Sie die Zellen mit einer sterilen serologischen Pipette in einem sauberen, sterilen konischen 50-ml-Röhrchen.
- 5 min bei 125 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml frischem Wachstumsmedium, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Um die Zellen zu zählen, geben Sie 10 μl der Zellsuspension zu 30 μl 0,4%iger Trypanblau-Lösung in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie dann 10 μl der Mischung unter das Deckglas einer Hämozytometer-Zählkammer.
- Zählen Sie mit einem Invers- oder Hellfeldmikroskop und dem 10-fach-Objektiv die ungefärbten (lebensfähigen) Zellen in vier der 1 mm2 Quadrate. Berechnen Sie die Zellzahl mit der Formel: Zellen/ml = Zellzahl/# 1 mm2 Quadrate x Verdünnungsfaktor x 104,
Anmerkung: In diesem Beispiel beträgt die Anzahl der gezählten 1 mm2 Quadrate vier, und der Verdünnungsfaktor beträgt 4.
- Verwenden Sie die Gleichung C1V1 = C2V2, um eine 1 x 105 Zellen/ml-Suspension zu berechnen und vorzubereiten. Bereiten Sie 1 ml Zelle/ml Suspension für jede Säule der zu befüllenden 96-Well-Platte und 0,75 mL für jede Kammer des 4-Well-Kammerobjektträgers vor, die je nach Plattendesign gefüllt werden soll.
Anmerkung: C1 = Zellzahl, V1 = was berechnet wird, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 ml.
- Bestimmen Sie V1 und subtrahieren Sie es von den gewünschten 5,50 ml des Gesamtvolumens, um das Volumen des frischen Mediums zu bestimmen, das zur Herstellung der Suspension benötigt wird. Das Volumen der Zellen (V1) aus der ursprünglichen Suspension wird mit dem Volumen des frischen Mediums auf insgesamt 5,50 ml mit 1 x 105 Zellen/ml addiert.
- Geben Sie 100 μl 1 x 10 5 Zellen/ml Suspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte entsprechend dem Plattendesign mit einer Mehrkanal-Mikropipette und 530 μl in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers mit einer Mikropipette entsprechend dem Plattendesign. Über Nacht inkubieren.
Anmerkung: Für dieses Experiment werden MSCs in den Spalten 1, 2, 3 und 6 der 96-Well-Platte (Tabelle 1) und in den Wells 1 und 2 des 4-Well-Kammerschiebers (Tabelle 2) plattiert. Daher werden mindestens 5,50 ml einer 1 x 105 Zellen/ml-Suspension hergestellt. MΦ bei 80% Konfluenz wird am selben Tag, an dem die MSCs in die Versuchsplatten ausgesät werden, mit Entzündungsmediatoren behandelt.
>3. Isolieren Sie das MΦ und bereiten Sie die Co-Kulturen vor, Tag 2
- Entfernen Sie das Aktivierungsmedium aus den MΦ-Zellen und ersetzen Sie es durch 5 mL frisches Wachstumsmedium. Kratzen Sie vorsichtig mit einem Zellheber ab und sammeln Sie die Zellen in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses und der Hämozytometrie, wie für MSC in den Schritten 2.6-2.7 beschrieben.
- Unter Verwendung der Gleichung in den Schritten 2.8-2.9 werden zwei separate Suspensionen von 2 x 105 Zellen/ml hergestellt, eine mit Zellen aus der Kontrolle und eine mit Zellen aus den behandelten MΦ-Kulturen.
Anmerkung: Bereiten Sie 1 ml Zelle/ml-Suspension für jede Säule der zu befüllenden 96-Well-Platte und 0,75 mL für jede Kammer des 4-Well-Kammerobjektträgers vor, die je nach Plattendesign gefüllt werden soll.
- Das Medium wird vorsichtig aus den Experimentiervertiefungen der 96-Well-Platte, die MSC enthält, abgesaugt. Mit einer Mehrkanal-Mikropipette werden 100 μl der behandelten und der Kontroll-MΦ-Zellsuspensionen in die entsprechenden Versuchsvertiefungen mit und ohne MSC entsprechend dem Plattendesign gegeben. Über Nacht inkubieren.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem 4-Well-Kammerobjektträger mit MSC ab und geben Sie mit einer Mikropipette 530 μl MΦ-Zellsuspension in die entsprechenden Vertiefungen entsprechend dem Design. Über Nacht inkubieren.
>4. Phagozytose-Assay, kinetisch fluoreszierende 96-Well-Platte, Tag 3
- Legen Sie die Assay-Parameter fest
- Schalten Sie am Tag des Assays den Fluoreszenzplattenleser ein und stellen Sie die Temperatur am System am Computer auf 37 °C ein.
- Öffnen Sie die System Pro-Software und überprüfen Sie das Instrumentensymbol in der oberen linken Ecke, um festzustellen, ob das Instrument mit dem Computer verbunden ist. Wenn der rote Kreis mit einer Linie sichtbar ist, klicken Sie auf das Instrumentensymbol und wählen Sie das Instrument im Popup-Fenster aus, um die Verbindung herzustellen.
- Wählen Sie Neues Experiment aus, um auf das Popup-Fenster Plate Setup Helper zuzugreifen. Wählen Sie im Menü "Plate Set-Up Helper" die Option "Erfassungseinstellungen konfigurieren" aus.
- Wählen Sie Monochromator aus dem Einstellungsmenü für die optische Konfiguration. Wählen Sie FL (Fluoreszenz) für den Lesemodus und Kinetisch für den Lesetyp.
- Klicken Sie im selben Konfigurationsfenster unter Kategorie auf Wellenlängen und stellen Sie dann die Bandbreiten auf 9 nm für die Anregung und 15 nm für die Emission ein.
- Legen Sie die Anzahl der Wellenlängenpaare auf 1 fest. Stellen Sie die Wellenlängen LM1 auf 510 nm für die Anregung und auf 540 nm für die Emission ein.
- Fahren Sie mit den Kategorien fort, und wählen Sie als nächstes Plattentyp aus. Wählen Sie die Option aus, die dem verwendeten Plattentyp entspricht.
Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Auswahl mit dem Plattentyp übereinstimmt. Die Lesehöhen werden vom System entsprechend der Auswahl eingestellt.
- Wählen Sie als Nächstes Bereich lesen aus, und markieren Sie den Bereich der 96-Well-Platte, der im Versuchsplan enthalten ist.
- Wählen Sie PMT und Optik, stellen Sie PMT Gain auf High und Blitze pro Messwert auf 6. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Von unten lesen, wenn Sie eine Platte mit klarem Boden verwenden.
- Wählen Sie Timing und legen Sie 10-Minuten-Intervalle über einen Zeitraum von 70 Minuten fest.
- Wählen Sie Schütteln aus, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Vor dem ersten Lesen und stellen Sie es auf 5 Sekunden ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zwischen Lesevorgängen und stellen Sie es auf 3 Sekunden ein. Legen Sie die Verwacklungsintensität für beide auf "Niedrig" und "Linear" fest.
- Schließen Sie das Fenster. Wenn das Hilfsfenster für die Platteneinrichtung angezeigt wird, wählen Sie Plattenlayout konfigurieren aus. Markieren Sie die BL-Vertiefungen des Plattendesigns und klicken Sie auf Plate Blank.
- Markieren Sie jede der experimentellen Zeilen, klicken Sie auf Hinzufügen, benennen Sie die Gruppe, und wählen Sie dann eine Farbe aus.
- Wählen Sie unter Zuweisungsoptionen unterhalb des Plattendesigns die Option Reihe, definieren Sie die Serie im Fenster und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Gruppe.
- Bereiten Sie die Zymosan-Suspension vor
- Während Sie darauf warten, dass die Systemtemperatur 37 °C erreicht, resuspendieren Sie 1 mg Zymosan-Partikel in 5 ml des Bildgebungsmediums für lebende Zellen.
- Geben Sie 1 ml Bildgebungsmedium für lebende Zellen in das Fläschchen mit den Partikeln und sammeln Sie sie in einem Glaskulturröhrchen. Spülen Sie das Fläschchen mit einem zusätzlichen 1 ml Bildgebungslösung und geben Sie es in dasselbe Glasröhrchen, um sicherzustellen, dass alle Partikel übertragen werden. Fügen Sie 3 ml zusätzliche Bildgebungslösung hinzu, um eine Partikelsuspension von 0,2 mg/ml zu erhalten.
- Vortex mit schnellen Impulsen für 30-60 s. Verwenden Sie dann einen Sonden-Ultraschallator, um mit 60 schnellen Impulsen zu beschallen.
Anmerkung: Es ist sehr wichtig, eine homogene Suspension der Partikel zu erzeugen und die Suspension nicht zu lange ruhen zu lassen, bevor sie in die Experimentiervertiefungen gegeben wird. Die Verklumpung tritt schnell wieder auf. Die Dichte der Partikel pro Zelle muss je nach Quelle, Behandlung und verwendeter Dichte von MΦ möglicherweise optimiert werden. In den vorgestellten Studien wurden konjugierte Zymosanpartikel verwendet. Es sind aber auch konjugierte E. coli und S. aureus erhältlich.
- Fügen Sie Zymosan hinzu und lesen Sie die Platte ab
- Aspirieren Sie das Medium aus den experimentellen Vertiefungen und spülen Sie 1x mit 100 μl der Lebendzell-Bildgebungslösung. Spülen Sie die RBL-Wells ebenfalls mit der Bildgebungslösung für lebende Zellen.
- Aspirieren Sie die Bildgebungslösung für lebende Zellen aus experimentellen und RBL-Wells und ersetzen Sie sie durch 100 μl der Zymosan-Partikelsuspension.
- Öffnen Sie die Plattenablage des fluoreszierenden Lesegeräts über die Touchpad-Schnittstelle. Legen Sie die Platte ohne Deckel in das Fach, wobei sich die Vertiefung A1 in der oberen linken Ecke befindet. Schließen Sie das Fach mit dem Touchpad und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Lesen im oberen Menü.
- Wenn der Lesevorgang abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner und exportieren Sie die Daten in ein Tabellenformat, indem Sie auf Datei klicken und Exportieren auswählen.
- Berechnen Sie den Mittelwert ± relativen REM-Fluoreszenz für jede Replikatgruppe zu jedem Zeitpunkt (10 min, 20 min, 30 min, etc.) in der Tabelle (Ergänzungsdatei 1) und übertragen Sie die Daten an eine Grafiksoftware.
- Verwenden Sie ein Liniendiagrammformat, um die Daten darzustellen, und wenden Sie eine bidirektionale ANOVA (Zeit x Behandlung/MSC als Faktoren) an, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, um Unterschiede zwischen einzelnen Gruppen zu ermitteln.
Anmerkung: Während die 96-Well-Plattenablesung ausgeführt wird, bereiten Sie die dynamische Speicherfolie für die Zeitraffer-Bildaufnahme vor. Stellen Sie sicher, dass die dynamische Bildgebung mit der Analyse einer Versuchsvertiefung nach der anderen fortfährt.
Tabelle 1: Beispiel für ein 96-Well-Plattendesign. CBL - Zelle leer; MSC - gesät Tag 1; MΦ+ behandelt und MΦ unbehandelt ausgesät Tag 2; RBL-Reagenzblanko, der am Tag 3 des Assays hinzugefügt wurde.
| 1 | arabische Ziffer | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ein | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| Vgl. | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabelle 2: Beispiel für ein Design mit 4-Well-Kammer. MSC - plattiert Tag 1; MΦ+ behandelt und MΦ unbehandelt plattiert Tag 2.
| 1 | arabische Ziffer | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
