Einbringen von bakteriellen Effektorproteinen in Säugetierzellen durch Elektroporation

Zusammenfassung

Quelle: Sontag, R. L. et al., Elektroporation von funktionellen bakteriellen Effektoren in Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir die Einführung von bakteriellen Effektorproteinen in Säugetierzellen durch Elektroporation. Die intrazelluläre Lokalisation der bakteriellen Effektorproteine wird durch konfokale Mikroskopie nach Färbung mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern nachgewiesen.

Protokoll

>1. Elektroporation

1. 400 μl Zellsuspension in eine vorgekühlte Küvette geben und 20 μg ausgewähltes Protein (50 μg/ml) in die Küvette geben.
2. Schnippen Sie die Küvette vorsichtig ~10 Mal, um zu mischen, ohne die Zellen zu beschädigen. Anmerkung: Die Küvette kann auch mehrmals umgedreht werden, um sie gründlich zu mischen, aber pipettieren Sie nicht auf und ab oder wirbeln Sie nicht, um eine Schädigung der Zellen zu vermeiden.
3. Trocknen Sie die Außenseite der Küvette mit einem Papiertuch oder einem anderen Wischer ab, um Lichtbögen im Elektroporator zu vermeiden.
4. Elektroporatprobe bei 0,3 kV für 1,5-1,7 ms. Hinweis: Dies war typisch für diese Studie.
5. Unmittelbar nach der Elektroporation schnippen Sie die Küvette vorsichtig ~10 Mal, um sie gründlich zu mischen.

>2. Beschichtung von Zellen

1. Lagern Sie die Küvette mit den elektroporierten Zellen auf Eis, bis sie in Auffangplatten eingelegt werden kann.
2. Für die meisten nachgeschalteten Analysen die Zellen 1x mit vorgewärmtem NGM waschen, um fremdes Effektorprotein zu entfernen.
   1. Entnehmen Sie die Zellen zur Analyse und suspendieren Sie sie in 3-5 ml NGM.
   2. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 900 x g für 4 min.
   3. Resuspendieren Sie in einem ausreichenden Volumen NGM für die gewünschte Plattengröße (z. B. 2 ml für eine 35-mm-Schale).
3. Entfernen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen für die nachgelagerte Analyse.
   1. Beispiel 1: Platte in Glasbodenschalen für die mikroskopische Analyse.
   2. Beispiel 2: Platte in Zellkulturkunststoff für Proteinanalysen, wie z. B. Affinitätsreinigungen.
4. Lassen Sie die Zellen mindestens 4 Stunden lang in äquilibrierten Platten in einer befeuchteten Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO₂ bei 37 °C erholen.

>3. Mikroskopische Analyse

1. Fixierung/Immunfluoreszenz-Färbung
   1. Waschen Sie die Zellen 1x mit sterilem PBS nach einer 4-stündigen Erholungsphase.
   2. Die Zellen in 100% Methanol für 2 min bei Raumtemperatur fixieren. Verwenden Sie so viel Methanol, dass die Zellen vollständig bedeckt sind (z. B. 2 ml für eine 35-mm-Schale).
   3. 3x mit sterilem PBS waschen.
   4. Permeabilisieren Sie Zellen mit 0,4% Triton X-100 in PBS für 15 min. Verwenden Sie z. B. 1 ml für eine Platte mit einem Durchmesser von 35 mm.
      1. Passen Sie die Länge der Permeabilisierung und die Stärke von Triton X-100 entsprechend dem Epitop und der Position des Zielproteins an. Anmerkung: Die besten Ergebnisse müssen für jedes Ziel empirisch bestimmt werden, die oben genannten Bedingungen sollten jedoch für die meisten zytosolischen Ziele ausreichend sein.
   5. Mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 Stunde bei RT blockieren. Verwenden Sie z. B. 1 ml für eine Platte mit einem Durchmesser von 35 mm.
   6. 3x mit PBS waschen.
   7. Der Primärantikörper wird über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schaukeln in einer Antikörperbindungslösung (0,1 % Triton X-100 und 1 % BSA in PBS) inkubiert. Verwenden Sie z. B. 0,5 ml für eine Platte mit einem Durchmesser von 35 mm.
      1. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers zur Antikörperverdünnung. Anmerkung: Zum Beispiel wurde der Streptavidin-bindende Peptid-Tag-Antikörper (SBP-Tag) in einer Verdünnung von 1:1.000 verwendet, während der PKN1-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 verwendet wurde.
   8. 4x mit PBS waschen.
   9. Mit einem geeigneten fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörper in einer Antikörperbindungslösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und lichtgeschützt inkubieren.
      1. Verwenden Sie beispielsweise Alexa 488 oder Alexa 647 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
         1. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers zur Antikörperverdünnung. (z. B. etwa 1:1.000 für diese Studie).
      2. Fügen Sie nach Bedarf weitere Flecken hinzu, z. B. 5 μM Weizenkeimaggglutinin (WGA), konjugiert mit Alexa 647 oder DAPI gemäß Herstellerempfehlung, für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   10. 5x mit PBS waschen und bis zum Abbild bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung	Cellgro	25-050-Cl
0,4 cm Gap-Einweg-Elektroporationsküvetten	Bio-Rad	Nr. 165-2088
100% Methanol	jegliche	N/A	Entflammbar, giftig
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A4919
Zellzählgerät - Hämozytometer oder Scharzähler	Beckman Coulter	Modell Z1
Inkubator für Zellkulturen	jegliche	N/A	Befeuchtete Atmosphäre mit 95 % Luft/5 % CO2 bei 37 °C
Zellkultur-Kunststoff	jegliche	N/A	Zellkulturflaschen/-platten, Pipetten, Röhrchen, Gummipolizisten
Dulbeccos Modifikation des Eagle's Medium (DMEM)	Cellgro	Nr. 10-013	Warm bis 37 °C
Elektroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fötales Rinderserum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Konfokales Fluoreszenzmikroskop	Ziess	Modell LSM 710
Glasbodenschalen für die Mikroskopie	Wilco Wells	HBSt-3522
HeLa-Zelllinie	ATCC	ATCC CCL-2
Minimales essentielles Medium (MEM)	Cellgro	Nr. 10-010	Warm bis 37 °C
Andere fluoreszierende Flecken (WGA, DAPI) in Verbindung mit Anti-Fade-Reagenz	jegliche	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Zelllinie	ATCC	TIB-71
Primärer Antikörper gegen das Ziel von Interesse	jegliche	N/A
Sekundärer Antikörper, konjugiert mit Fluorophor	jegliche	N/A
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	jegliche	N/A	Kühl auf 4 °C
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung	jegliche	N/A	Warm bis 37 °C
Tischzentrifuge, die konische Röhrchen aufnehmen kann (schwingender Eimer bevorzugt)	jegliche	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Nr. T8585	Reizend, giftig