Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Anbau von Malassezia unter Laborbedingungen
HINWEIS: Lagern Sie alle Reagenzien und Medien, die für dieses Protokoll verwendet werden, bei Raumtemperatur (RT, 20 – 25 °C), sofern nicht anders angegeben, da die niedrigere Temperatur das Pilzwachstum hemmen kann.
- Bereiten Sie das flüssigmodifizierte Dixon (mDixon) Medium für das Malassezia-Wachstum vor. Zur Herstellung von 500 ml flüssigem mDixon-Medium werden 18 g Malzextrakt, 10 g getrocknete Ochsengalle, 5 ml Tween-40, 3 g Pepton, 1 ml Glycerin und 1 ml Ölsäure in 500 ml destilliertem H2O (dH2O) aufgelöst. Stellen Sie das Medium mit HCl und Autoklav auf pH 6 ein. Lagern Sie das Medium bei RT.
- Bereiten Sie mDixon-Agarplatten vor, indem Sie vor dem Autoklavieren 7,5 g Agar zu 500 mL mDixon-Medium hinzufügen. Kühlen Sie den mDixon-Agar nach dem Autoklavieren mit einer Lenkstange und einer magnetischen Heizplatte langsam ab, um eine teilweise Erstarrung des Mediums während des Abkühlens zu vermeiden.
- Sobald der Agar auf 50 – 60 °C abgekühlt ist, geben Sie die Flüssigkeit in einer Laminar-Flow-Haube in Petrischalen und lassen Sie sie über Nacht bei RT trocknen.
Anmerkung: Die Agarplatten können mehrere Wochen bei 4 °C gelagert werden, wenn sie eingewickelt und auf dem Kopf stehend aufbewahrt werden, um eine Verdunstung zu vermeiden.
- Besorgen Sie sich Malassezia-Isolate und beleben Sie lyophilisierte Malassezia-Bestände gemäß den Anweisungen des Anbieters.
- Beimpfen Sie 10 ml flüssiges mDixon-Medium in einem sterilen 100-ml-Erlenmeyerkolben mit der wiederbelebten Malassezia-Suspension gemäß den Anweisungen des Anbieters. Inkubieren Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator bei 30 °C und 180 U/min.
- Untersuchen Sie das Wachstum der Malassezia-Kultur regelmäßig, indem Sie auf das Auftreten von Cremefarbe und Trübungen prüfen. Die Wachstumskinetik hängt von der Art und dem Stamm von Malassezia ab und kann besonders langsam sein, wenn Malassezia frisch aus einem lyophilisierten Bestand wiederbelebt wird. (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie Glycerinbrühen vor, indem Sie 3 Teile der dicht gewachsenen Malassezia-Kultur in mDixon-Medium mit 1 Teil sterilem 99%igem Glycerin mischen. Das Malassezia/Glycerin-Gemisch wird in sterile Schraubröhrchen aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
- Für die In-vitro-Vermehrung wird Malassezia aus der Flüssigkultur in mDixon oder aus dem gefrorenen Glycerinstamm mit einer Impfschlaufe auf eine mDixon-Agarplatte (von 4 °C auf RT gebracht) aufgegossen.
Anmerkung: Übertragen Sie mDixon-Agarplatten vor der Verwendung ab 4 °C auf RT, da kalter mDixon-Agar das Pilzwachstum hemmt.
- Inkubieren Sie die Agarplatte(n) mit Malassezia kopfüber in einem aN-Inkubator (nicht schüttelnd) bei 30 °C. Kontrollieren Sie regelmäßig das Wachstum der Malassezia-Kolonien.
HINWEIS: Malassezia-Kolonien auf mDixon-Agar-Platten erscheinen innerhalb von 3 - 5 Tagen und sind cremefarben, matt und glatt mit konvexer Erhebung (Abbildung 1B).
- Lagern Sie Malassezia-Kolonien auf mDixon-Agarplatten bei RT für ~ 2 Wochen. Danach wird eine neue mDixon-Agarplatte hergestellt, indem Malassezia aus dem gefrorenen Glycerinbestand gestreift wird, wie in 1.7 beschrieben.
>2. Vorbereitung des Inokulums für eine experimentelle Malassezia-Infektion von Mäusen
- 10 mL flüssiges mDixon-Medium in einem sterilen 100 mL Erlenmeyerkolben mit 3 - 5 einzelnen Malassezia-Kolonien aus einer mDixon-Agarplatte inokulieren (siehe Schritt 1, Abbildung 1B).
- Inkubieren Sie die Malassezia-Kultur für ~ 48 bis 96 h bei 30 °C und 180 U/min, bis die Kultur cremefarben und trüb ist (Abbildung 1A).
Anmerkung: Die Zeit, die für das Wachstum von Malassezia benötigt wird, hängt von der Malassezia-Art und dem Stamm sowie der Menge des Pilzes ab, der für die Impfung verwendet wird.
- 2 ml der Malassezia-Kultur in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 1 Minute lang bei 10.000 x g zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, indem Sie es in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) suspendieren. Nochmals 1 min bei 10.000 x g zentrifugieren.
- Nach dem Waschen wird das Pellet durch kräftiges Pipettieren in 1 ml PBS suspendiert und die optische Dichte der Lösung bei 600 nm (ODA600) mit einem Spektrometer gemessen. Verdünnen Sie die Malassezia-Suspension 20 – 50 x mit PBS für die OD-Messung, um sicherzustellen, dass der Messwert zwischen 0,1 und 1,
Anmerkung: Die Dichte einer 3-Tage-Kultur von Malassezia variiert im Allgemeinen zwischen 15 und 30 ODA600, abhängig von der Malassezia-Spezies und dem Stamm sowie von der Anzahl der Hefezellen, die für die Inokulation der Kultur verwendet werden (Schritt 2.1). Malassezia neigt zur Bildung von Aggregaten, daher ist ein kräftiges Pipettieren erforderlich, um die Homogenität der Suspension zu gewährleisten.
- Aliquotieren Sie ein Volumen der Malassezia-Suspension in PBS, das einer Dichte von 4 ODA600 entspricht, in ein steriles 2-ml-Röhrchen. Bereiten Sie 1 Röhrchen pro Tier vor, das infiziert werden soll.
- Die Röhrchen mit Malassezia werden 1 min lang bei 10.000 x g zentrifugiert.
- Den Überstand verwerfen und das Malassezia-Pellet in 200 μl nativem Olivenöl (entsprechend 2 ODA600 Hefezellen/100 μl Olivenöl) suspendieren.
Anmerkung: Es wurde festgestellt, dass Olivenöl ein gutes Vehikel für eine epikutane Infektion mit Malassezia ist, da Malassezia eine lipophile und lipidabhängige Hefe ist. Olivenöl wird besser von der Haut aufgenommen als PBS. Beachten Sie jedoch, dass es nicht einfach ist, Malassezia in Olivenöl zu suspendieren. Die Malassezia/Olivenöl-Suspension durch Vortexen verbessern. Bewahren Sie die Suspension bei RT auf, bis sie zur Infektion verwendet wird.
- Bereiten Sie die Röhrchen nur mit Olivenöl für die Scheininfektion von Kontrolltieren vor.
>3. Mäuse mit Malassezia infizieren
- Bestellen Sie weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 - 8 Wochen und lassen Sie sie mindestens eine Woche lang in der Versuchstieranlage akklimatisieren. Rechnen Sie mit 3 - 5 Mäusen pro Gruppe, einschließlich einer nicht infizierten Kontrollgruppe.
- Bereiten Sie einen sterilen Anästhesiecocktail vor, der 1,3 mg/ml Xylazin und 6,5 mg/ml Ketamin in PBS enthält. 5 ml des Anästhesiecocktails reichen aus, um 20 Tiere zu betäuben. Passen Sie die Lautstärke des Cocktails an die Anzahl der zu betäubenden Tiere an.
- Betäubung der Tiere durch intraperitoneale Injektion von 10 μl/g Körpergewicht des Anästhesiecocktails (entsprechend 65 mg Ketamin und 13 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) und Abgabe der anästhesierten Tiere auf ein Heizkissen bei 37 °C.
Anmerkung: Bei der angegebenen Dosis bleiben die Tiere in der Regel ~ 30 - 60 min narkotisiert.
- Überprüfen Sie die Reflexe, indem Sie den hinteren Fuß mit einer Pinzette einklemmen, um sicherzustellen, dass die Tiere vollständig betäubt sind.
- Tragen Sie eine Augencreme auf die Augen auf, um eine Austrocknung während der Anästhesie zu verhindern.
- Optional können Sie die Ohrdicke beider Ohren mit einem Messschieber (Bereich 0 - 5 mm) messen. Messen Sie zwei verschiedene Bereiche jedes Ohrs und berechnen Sie die durchschnittliche Ohrdicke pro Ohr.
Anmerkung: Die Messung der Ohrdicke ist optional und hängt von der Forschungsfrage ab. Wenn jedoch die Ohrdicke als Messwert für Hautentzündungen verwendet wird, ist es notwendig, die Ausgangsohrdicke vor der Infektion zu messen. (siehe Schritt 4).
- Optional können Sie die epidermale Barriere der dorsalen Ohrhaut durch leichtes Tape-Stripping durchbrechen: Bringen Sie manuell ein kleines Stück Tape auf die Haut an und entfernen Sie es wieder. Wiederholen Sie dies in 5 aufeinanderfolgenden Runden mit einem frischen Stück Klebeband für jede Runde.
HINWEIS: Malassezia induziert eine ausgeprägtere Hautentzündung bei barrieregestörter Haut im Vergleich zu ungestörter Haut (Abbildung 2A).
- 100 μl (2 ODA600) der Malassezia/Olivenöl-Suspension mit einer sterilen Pipette topisch auf die dorsale Seite jedes Ohrs auftragen. Eine Kontrollgruppe von Tieren, die nur mit Olivenöl behandelt werden (mit Vehikeln behandelte Kontrollgruppe), ist einzubeziehen.
Anmerkung: Wirbeln Sie die Malassezia/Olivenöl-Suspension kräftig ein, um unmittelbar vor der Anwendung eine homogene Malassezia-Suspension zu gewährleisten.
- Lassen Sie die betäubten Tiere auf dem Heizkissen, um eine Unterkühlung zu vermeiden, bis sie Anzeichen einer Genesung zeigen (Schnurrhaarbewegungen, erhöhte Atemfrequenz usw.).
- Injizieren Sie 200 μl sterile und vorgewärmte 2%ige Glukoselösung subkutan in die Nackenfalte, um deren Stoffwechsel und Rehydrierung zu unterstützen.
Anmerkung: Um eine sterile 2%ige Glukoselösung herzustellen, lösen Sie 1 mg Glukose in 50 mL PBS auf und filtrieren Sie sie mit einem 0,2 μm Filter. Die Lösung kann bei 4 °C gelagert werden.
- Bringen Sie die Tiere zurück in ihren Käfig.
>4. Analyse von Malassezia-induzierten Hautentzündungen
HINWEIS: Dieses Verfahren beschreibt die Analyse der Malassezia-induzierten Ohrschwellung während einer Infektion, die als Parameter der Hautentzündung dient. Voraussetzung für die Analyse der pilzinduzierten Ohrschwellung ist die Messung der Ausgangsohrdicke vor dem Tape-Stripping und/oder der Infektion (Schritt 3.5).
- Bereiten Sie die Isoflurankammer für die Kurzzeitanästhesie von Malassezia-infizierten und Kontrolltieren vor.
- Bringen Sie jeweils ein Tier in die Kammer und warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt ist.
Anmerkung: Zu den Anzeichen einer ordnungsgemäßen Anästhesie gehören die vollständige Entspannung des Körpers sowie eine langsame und schwere (Flanken-)Atmung. Überwachen Sie die Anästhesie sorgfältig, da eine längere Exposition gegenüber Isofluran tödlich sein kann.
- Nehmen Sie das Tier aus der Kammer und legen Sie es auf ein Taschentuch.
- Messen Sie die Dicke des Ohrs/der Ohren mit einem Messschieber (Bereich 0 - 5 mm). Messen Sie zwei verschiedene Bereiche jedes Ohrs und berechnen Sie die durchschnittliche Dicke pro Ohr (siehe Schritt 3.5).
- Bringen Sie das Tier zurück in den Käfig.
Anmerkung: Die Isofluran-Anästhesie ist sehr kurzlebig und die Tiere erholen sich innerhalb von ~ 30 s nach der Entnahme aus der Isofluran-Kammer.
- Berechnen Sie die Zunahme der Ohrdicke, indem Sie die durchschnittliche Ohrdicke, die vor dem Abziehen des Klebebandes und/oder der Infektion gemessen wurde, von der durchschnittlichen Ohrdicke subtrahieren, die zu jedem Zeitpunkt nach der Infektion gemessen wurde.
- Stellen Sie die berechneten Werte als Zunahme der Ährendicke oder alternativ als Gesamtdicke der Ähren im Laufe der Zeit für jedes Tier oder jede Tiergruppe dar (Abbildung 2B).
>5. Analyse der Pilzbelastung in der infizierten Haut
- Für jedes zu entnehmende Ohr ist ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorzubereiten, das 0,5 ml steriles 0,05 % Nonidet P40 (NP40) in dH2O und eine autoklavierte Stahlkugel (5 mm Durchmesser) enthält.
- Wiegen Sie die Rohre mit einer Präzisionswaage und notieren Sie das genaue Gewicht.
- Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO2 -Erstickung.
- Entfernen Sie das/die Ohr(e) an der Basis und geben Sie es in das Röhrchen mit 0,5 ml sterilem 0,05 % NP40 in dH2O, wie in den Schritten 5.1 - 5.2 beschrieben.
- Wiegen Sie das Röhrchen, das das Ohrgewebe enthält, und berechnen Sie das tatsächliche Gewicht jeder Probe, indem Sie das Gewicht des Röhrchens ohne das Organ vom Gewicht des Röhrchens mit dem Organ abziehen.
- Homogenisieren Sie das Ohrgewebe für 6 min bei 25 Hz mit einem Gewebehomogenisator. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe gut homogenisiert ist.
- 100 μl jeder Probe (entsprechend 1/5 jedes Homogenats, Verdünnungsfaktor = 5) auf mDixon-Agarplatten auffüllen und die Platten kopfüber in einem 30°C-Inkubator inkubieren.
Anmerkung: Die Menge des plattierten Homogenats sollte entsprechend der zu erwartenden Pilzbelastung angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass genügend Homogenat auf der Platte vorhanden ist, um mindestens 10 und nicht mehr als 250 Kolonien pro Platte zu erhalten, um eine einfache Zählung zu ermöglichen. Optional können mehrere Platten pro Probe mit unterschiedlichen Verdünnungen des Homogenats plattiert werden.
- Kontrollieren Sie regelmäßig das Wachstum der Malassezia-Kolonien.
Anmerkung: Kolonien werden in der Regel nach 2 - 3 Tagen sichtbar. Die Zeit, die Malassezia-Kolonien zum Wachsen benötigen, hängt von der Art und dem Stamm von Malassezia ab.
- Zählen Sie die Völker pro Platte.
- Berechnen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, KBE/g Gewebe, mit der folgenden Formel:
KBE/g Gewebe = (Anzahl der Kolonien/Platte) x (Verdünnungsfaktor) / (Gewicht der Hautprobe in g).
Anmerkung: Die ungefähre minimale Nachweisgrenze kann mit der folgenden Formel bestimmt werden: minimale Nachweisgrenze = (1 Kolonie/Platte) x (Verdünnungsfaktor) / (durchschnittliches Gewicht aller Hautproben in g).
- Pilzbelastungen werden in der Regel auf einer logarithmischen Skala dargestellt (Abbildung 2C).
