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>1. Mtb-Infektion von Monozyten-abgeleiteten Zellen
HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen in einer BSL-3-Einrichtung durchgeführt werden.
- Resuspendieren Sie das Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Pellet in serumfreiem RPMI-Medium in einem neuen sterilen 50-ml-Röhrchen und stellen Sie die endgültige Bakterienkonzentration auf ca. 5 x 106 KBE/ml ein.
- Entfernen Sie das Zellkulturmedium von der/den 6-Well-Platte(n), die Monozyten-abgeleitete Zellen enthalten. Geben Sie 1 ml serumfreies RPMI-Medium in jede Vertiefung. Fügen Sie 1 ml Bakteriensuspension pro Vertiefung hinzu, um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 5:1 zu erhalten, d. h. 5 x 106 KBE pro 106 Makrophagen in 2 ml/Vertiefung, und inkubieren Sie die Platten 4 h lang bei 37 °C und 5 % CO2.
- Waschen Sie die Zellen nach der Infektion 3 Mal mit 1 ml sterilem Waschpuffer, um extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Kippen Sie die Platte und entfernen Sie vorsichtig den gesamten Waschpuffer aus den Ecken. Resuspendieren Sie die Mtb-infizierten Monozyten-abgeleiteten Zellen in 2 ml RPMI-Komplettmedium ohne Antibiotika und fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort, färben Sie die Zellen oder inkubieren Sie sie für weitere 24 Stunden (oder zu anderen Zeitpunkten), bevor Sie die Durchflusszytometrie durchführen.