Ein Assay zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin bei der bakteriellen Adhärenz an Epithelzellen des Wirts

Zusammenfassung

Quelle: Singh, B. et al., Assays zur Untersuchung der Rolle von Vitronectin bei bakterieller Adhäsion und Serumresistenz. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, um die Rolle von Vitronektin bei der Adhärenz von Haemophilus influenzae an den Wirtsepithelzellen zu untersuchen.

Protokoll

1. Untersuchung der Vn-abhängigen Adhärenz von Bakterien an Epithelzellen

1. Kultivieren Sie A549-Zellen (Alveolarepithelzellen vom Typ II) in einem 75 cm großen 2-Gewebekulturkolben mit F12-Medium, ergänzt mit 10 % (vol/vol) fötalem Kälberserum (FCS) (vollständiges Medium) und 5 μg/ml Gentamicin. Der Kolben wird in einem Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C 3 Tage lang inkubiert, bis 80 % konfluent sind (die Konfluenz kann durch Visualisierung der Oberflächenbedeckung durch die Zellen mit einem inversen Mikroskop geschätzt werden). In den folgenden vier Schritten wird beschrieben, wie die Epithelzellen für den Assay vorbereitet werden.
   1. Die Zellmonoschicht im Kolben wird zweimal mit 20 ml PBS durch leichtes Schwenken gewaschen. Um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen, fügen Sie 2 ml Zellablösungsenzymlösung hinzu und inkubieren Sie den Kolben 5 Minuten lang bei 37 °C. Klopfen Sie mit der Handfläche auf den Kolben, um alle Zellen von der Kunststoffoberfläche zu lösen. Pipettieren Sie ein paar Mal auf und ab, um Zellklumpen zu zerstreuen.
   2. 18 ml F12-Vollmedium werden in den Kolben gegeben und die gesamte Zellsuspension in ein steriles 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt. Die Zellsuspension wird 5 min lang bei 200 x g bei RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml F12 Komplettmedium.
   3. Entfernen Sie 10 μl der Zellsuspension und geben Sie sie in ein Eppendorf-Röhrchen, dann fügen Sie 90 μl Trypanblau-Lösung hinzu. Laden Sie die Probe in ein Hämozytometer (Tiefe 0,1 mm), nachdem Sie das Deckglas platziert haben.
   4. Zählen Sie alle lebensfähigen Zellen in den Bereichen A, B, C und D (jedes Feld besteht aus 16 Quadraten, und jedes Quadrat hat eine Fläche von 0,0025 mm²) und berechnen Sie dann die durchschnittliche Anzahl der Zellen ([A+B+C+D]/4). Berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit der folgenden Gleichung:
      Lebensfähige Zellen/ml = durchschnittliche Zellzahl × 10⁴ × Verdünnungsfaktor.
      Anmerkung: Hier beträgt der Verdünnungsfaktor 10.
   5. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5,0 x 10³ Zellen/ml mit einem vollständigen Medium, das 5 μg/ml Gentamicin enthält. Geben Sie 500 μl Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte. Die Platte wird bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert, bis die Zellen zu 90 % zusammenfließen
   .
2. Vor einer bakteriellen Infektion das Medium aus den Vertiefungen nehmen und F12-Medium (ohne FCS) hinzufügen, dann über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Waschen Sie die Zellmonoschicht dreimal mit 500 μl PBS bei RT. Stellen Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 100 μl vorgekühltes F12-Medium mit 10 μg/ml Vn hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 4 °C für 1 h. Fügen Sie für Kontrollvertiefungen nur F12-Medium hinzu.
4. Nach der Inkubation verwerfen Sie die Lösung durch Pipettieren und waschen Sie die Zellschicht zweimal mit 1 ml PBS bei RT.
5. Kultur Hif klinische Isolate in Gehirn-Herz-Infusionsmedium (BHI), ergänzt mit 10 μg/mL NAD und Hämin bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min. Verwenden Sie Luria-Bertani-Medium, um E. coli zu kultivieren. Ernten Sie Hif in der Mid-Log-Phase (OD600 = 0,3) und resuspendieren Sie die Bakterien in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, die 1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) enthält (Blockierungspuffer; PBS-BSA). Die Federung ist auf 10⁹ KBE/ml einzustellen. Resuspendieren Sie eine Kultur mit frisch gezüchtetem Hif M10 in F12-Medium (2×10⁸ KBE/ml). Geben Sie 100 μl dieser Bakteriensuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 2 h lang bei 37 °C.
   Anmerkung: Jede Vertiefung enthält ca. 2 x 10⁵ A549 Zellen. Zur Infektion wurden 2 x 10⁷ bakterielle KBE zugegeben, was einer Infektionsvielfalt von 100 entspricht.
6. Entfernen Sie das Medium durch Pipettieren und waschen Sie die A549-Epithelzellen dreimal mit PBS. Geben Sie 50 μl/Vertiefung Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C.
7. Fügen Sie anschließend 50 μl F12-Vollmedium pro Vertiefung hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Epithelzellen (≈100 μl [d. h. das gesamte Volumen]) aus jeder Vertiefung in ein 6-ml-Glasröhrchen mit vier Glaskügelchen. Lysieren Sie die Zellen bei RT, indem Sie sie 2 Minuten lang vortexen.
8. 10 μl des Zelllysats werden 100-fach verdünnt, indem 10 μl Lysat zu 990 μl F12-Medium hinzugefügt werden. 10 μl der verdünnten Probe auf eine Schokoladen-Agar-Platte auffüllen.
9. Inkubieren Sie die Schokoladen-Agar-Platte bei 37 °C über Nacht, dann zählen Sie die Kolonien. Jede Kolonie repräsentiert eine KBE.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden	BD Falke	Tel.: 60819-138	12 × 75 mm Ausführung
5% CO2 versorgter Inkubator	Thermo Scientific	BBD6220
6 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden	VWR	Tel.: 89000-478	12 × 75 mm Ausführung mit Kappe
24-Well-Platten	BD Falke	08-772-1H	Qualität von Zellkulturen
75 cm2 Gewebekulturkolben	BD Falke	BD353136	entlüftet
A549 Zelllinie Mensch	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 86012804-1VL
Enzym zur Zellablösung (Accutase)	Sigma-Aldrich	Nr. A6964-500ML	Zellkultur-Qualität
Rinderserumalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A2058	Geeignet für Zellkulturen
F12 mittel	Sigma-Aldrich	Nr. D6421	Zellkultur-Qualität
Fötales Kälberserum (FCS)	Sigma-Aldrich	Nr. 12003C	Geeignet für Zellkulturen
Hämozytometer	Marienfeld	Artikel-Nr.: 640210
Gewebekultur-Kolben	BD Falke	3175167	75 cm2
Vitronectin (Vn) aus menschlichem Plasma	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Qualität von Zellkulturen