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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Analyse der Vn-abhängigen Resistenz gegen die bakterizide Aktivität von Humanserum
- Kaufen Sie normales Humanserum (NHS) von einer kommerziellen Quelle. Bereiten Sie Vitronektin oder Vn-abgereichertes Serum (VDS) vor. Füllen Sie den VDS mit 180 nM Vn auf, was dem im NHS vorhandenen Vn entspricht.
- Bereiten Sie hitzeinaktiviertes Serum (KIS) vor, indem Sie NHS 30 Minuten lang auf 56 °C erhitzen, um Komplementproteine zu inaktivieren.
Anmerkung: Die optimale Serumkonzentration (5%) und Inkubationszeit (15 min) für den Assay wurden empirisch für Haemophilus influenzae Typ f (Hif) bestimmt; Diese Parameter können bei anderen bakteriellen Krankheitserregern variieren.
- Kulturbakterien (in diesem Fall Hif M10 und die mutierte Hif M10Δlph) in die mittlere logarithmische Phase (OD600 = 0,3). Pelletbakterien durch Zentrifugation bei 3.500 x g für 10 min.
- Resuspendieren Sie das Bakterienpellet mit 1 Volumen Dextrosegelatine-Veronal-Puffer (DGVB++; pH 7,3) mit 2,5 % (w/v) Glukose, 2 mM Magnesiumchlorid, MgCl2, 0,15 mM Calciumchlorid, CaCl2 und 0,1 % (wt/vol) Gelatine.
- Geben Sie 1,5 x 103 koloniebildende Einheiten (KBE) Bakterien zu 100 μl DGVB++ mit 5 % Serum (NHS, HIS, VDS oder VDS+180 nM Vn). Die Probe wird 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und bei 300 U/min geschüttelt
.
- Entfernen Sie ein 10 μL Aliquot aus dem Reaktionsgemisch bei 0 min (T0 Probe) und 15 min (Tt Probe) und geben Sie es auf Schokoladenagar. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C.
- Zählen Sie nach der Inkubation die Kolonien, die auf dem Teller erscheinen. Berechnen Sie den Prozentsatz der abgetöteten Bakterien anhand der folgenden Gleichung: (koloniebildende Einheit oder KBE bei Tt)/(KBE bei T0) × 100.