Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Dissektion und Infektion der Gebärmutterhalsschleimhaut
HINWEIS: Für optimale Ergebnisse sollten Explantate von Zervixschleimhäuten so schnell wie möglich nach der Operation verarbeitet und infiziert werden, idealerweise am selben Tag der Operation. Alternativ können die Proben über Nacht in CMT (mit Antibiotika ergänzte Nährmedien) bei 4 °C gelagert und sofort nach der Dissektion infiziert werden.
- Lassen Sie dem CM genügend Zeit, um die RT zu erreichen, oder legen Sie ihn in ein auf 37 °C vorgewärmtes Wasserbad. Ergänzen Sie den CM vor der Anwendung mit einer Antibiotikalösung (CMT). Entsorgen Sie alle übrig gebliebenen Antibiotikalösungen. Gießen Sie 70%ige Ethanollösung in einen sauberen Behälter, um die Pinzette und das Skalpell bei Bedarf während des Seziervorgangs einzuweichen. Reinigen Sie die Werkzeuge und wechseln Sie die Skalpellklinge zwischen der Sektion von Proben von mehreren Spendern.
- Übertragen Sie die Probe mit einer sterilen Pinzette aus dem Transportbehälter in eine 100-mm-Petrischale, die 10–20 ml CMT enthält.
- Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schneidefläche, um das Gewebe zu präparieren. Halten Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette fest und trennen Sie die Schleimhaut des Ektozervix und/oder des Endozervix mit einem Skalpell und einer Klinge vom darunter liegenden Stroma- und Muskelgewebe (Submukosa), um Schleimhautstreifen zu erhalten
Anmerkung: Bei der Arbeit an einem Gewebestück ist es wichtig, den Rest des Gewebes in ein Medium einzutauchen, um eine Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.
- Schneiden Sie die Schleimhaut in 2 mm breite Streifen, entfernen und entsorgen Sie so viel Submukosa wie möglich, so dass nur eine 2 mm dicke Gewebeschicht übrig bleibt. Schneiden Sie die Streifen in 2 mm dicke Blöcke. Daraus sollten Gewebeexplantate von etwa 8 mm3,
Vorsicht: Der Umgang mit scharfen Werkzeugen zum Sezieren menschlicher Proben erhöht das Risiko von Verletzungen und Verunreinigungen. Der Bediener sollte das Tragen von Metall-, Netz- und Schnittschutzhandschuhen als zusätzlichen Schutz in Betracht ziehen.
- Übertragen Sie Gewebeexplantate in eine neue 100-mm-Petrischale mit 10–20 ml CMT, um eine Austrocknung des Gewebes während der Dissektion zu vermeiden. Schwenken Sie die Platte am Ende der Dissektion, um die Explantatverteilung zu randomisieren.
- Übertragen Sie die Explantate mit einer sterilen Pinzette in das/die sterile(n) konische(n) 1,5-ml-Röhrchen (maximal 16 Explantate pro Röhrchen). Entfernen Sie das Medium im Röhrchen mit einer Pipette.
- Tauen Sie das HIV-1-Präparat in einem Wasserbad bei 37 °C auf. Falls erforderlich, wird der Virusbestand mit CM verdünnt. Übertragen Sie das Virus in die Röhrchen mit den Explantaten. Entsorgen Sie alle Viruspräparate, die übrig geblieben sind.
Anmerkung: Der Virusbestand sollte so verdünnt werden, dass das ausgewählte Inokulum in einem Volumen von mindestens 0,5 mL enthalten ist (Tabelle 1). Um die Variabilität der Ergebnisse zwischen unabhängigen Experimenten zu verringern, sollte das gleiche Viruspräparat für eine gesamte Studie verwendet werden (Table of Materials).
- Übertragen Sie die Röhrchen in einen Thermoschüttler und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei 37°C und schaukeln Sie bei 300 U/min. Drehen Sie die Röhren einige Male vorsichtig alle 30–60 Min. um.
Hinweis: Für eine effiziente Infektion ist es wichtig, die minimale Zeit zwischen dem Auftauen des HIV-1-Präparats und dem Übertragen der Röhrchen auf 37 °C zu nutzen.
- Füllen Sie eine 6-Well-Platte mit 3–4 ml steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) pro Well. Nach der Inkubation mit HIV-1 ist das gesamte Viruspräparat in den Röhrchen mit einer Pipette in einen Behälter mit einer Desinfektionslösung zu entsorgen. Übertragen Sie die Explantate mit einer Pinzette in die 6-Well-Platte, die PBS enthält.
- Lassen Sie die Explantate 1 Minute lang bei RT in PBS ruhen und waschen Sie sie dann, indem Sie das PBS 2-3 Mal vorsichtig auf und ab in die Vertiefung pipettieren. Entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette in einen Behälter mit einer Desinfektionslösung. Geben Sie 3–4 ml neues PBS in jede Vertiefung. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal für insgesamt drei Wäschen. Entsorgen Sie das PBS kurz vor dem Transfer der Explantate in die Schwämme, um eine Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.
Anmerkung: Explantate der Zervixschleimhaut, insbesondere der Endozervix, setzen bei der Infektion große Mengen an Schleim frei. Es ist wichtig, so viel Schleim wie möglich zu waschen und zu entfernen, da eine unspezifische Retention auf Explantaten und die anschließende Freisetzung des Virus in den Kulturüberstand die Virusreplikation verschleiern kann.
- Übertragen Sie mit einer Pinzette 5-8 Explantate auf jeden Gelatineschwamm in eine 12-Well-Platte. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
- Entsorgen Sie alle biologischen Abfälle in gegenüberliegenden Behältern gemäß den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologika und der spezifischen Risikobewertung.
