Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays

Abstract

Quelle: Bego, M. G. et al., Bewertung der angeborenen Wahrnehmung von HIV-1-infizierten CD4⁺ T-Zellen durch plasmozytoide dendritische Zellen unter Verwendung eines ex vivo Co-Kultursystems. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt einen sekretierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Assay unter Verwendung von HEK-Blue Interferon-α/β-Reporterzellen zur Quantifizierung der Typ-I-Interferone (IFNs), die nach Stimulation plasmazytoider dendritischer Zellen durch HIV-1-infizierte CD4⁺ T-Zellen freigesetzt werden.

Protocol

>1. Messung von bioaktivem Typ-I-IFN mit HEK-Blue IFN-α/β Reporterzellen.

Hinweis: Diese Zellen wurden durch stabile Transfektion von HEK293-Zellen mit den humanen Genen STAT2 und IRF9 erzeugt, um einen vollständig aktiven Typ I IFN-Signalweg zu erhalten. Sie enthalten auch das sezernierte Reportergen für alkalische Phosphatase (SEAP), das vom IFN-α/β-induzierbaren ISG54-Promotor kontrolliert wird. Die Stimulation dieser Zellen mit Typ-I-IFN aktiviert den JAK/STAT/ISGF3-Signalweg und induziert die Produktion von SEAP.

1. Halten Sie HEK-Blue IFN-α/β-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Plattieren Si....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MT4-Zellen	NIH AIDS-Reagenzienprogramm	Nr. 120	Dieses Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 von Dr. Douglas Richman erhalten.
HEK-Blu IFN-α/β Reporterzellen	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	Wisent	350-000-CL
DMEM	Wisent	319-005-CL
FBS	Wisent	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	Nr. O2769
CD4+ T-Zell-Isolationskit II	Myltenyi	Tel.: 130-091-155
Diamant-Plasmazytoid-Isolationskit für dendritische Zellen II	Myltenyi	Tel.: 130-097-240
QUANTI-Blau	Zedernlan	REP-QB2
2,5 mg/ml humanes IgG	Sigma-Aldrich	I 4506