Quantifizierung von bioaktiven Typ-I-Interferonen mit Hilfe eines sezernierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Reporter-Assays

Zusammenfassung

Quelle: Bego, M. G. et al., Bewertung der angeborenen Wahrnehmung von HIV-1-infizierten CD4⁺ T-Zellen durch plasmozytoide dendritische Zellen unter Verwendung eines ex vivo Co-Kultursystems. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt einen sekretierten embryonalen alkalischen Phosphatase-Assay unter Verwendung von HEK-Blue Interferon-α/β-Reporterzellen zur Quantifizierung der Typ-I-Interferone (IFNs), die nach Stimulation plasmazytoider dendritischer Zellen durch HIV-1-infizierte CD4⁺ T-Zellen freigesetzt werden.

Protokoll

>1. Messung von bioaktivem Typ-I-IFN mit HEK-Blue IFN-α/β Reporterzellen.

Hinweis: Diese Zellen wurden durch stabile Transfektion von HEK293-Zellen mit den humanen Genen STAT2 und IRF9 erzeugt, um einen vollständig aktiven Typ I IFN-Signalweg zu erhalten. Sie enthalten auch das sezernierte Reportergen für alkalische Phosphatase (SEAP), das vom IFN-α/β-induzierbaren ISG54-Promotor kontrolliert wird. Die Stimulation dieser Zellen mit Typ-I-IFN aktiviert den JAK/STAT/ISGF3-Signalweg und induziert die Produktion von SEAP.

1. Halten Sie HEK-Blue IFN-α/β-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Plattieren Sie sie mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und einem Endvolumen von 180 μl.
2. Mischen Sie 220 μl PBMC (verdünnt auf 850.000 Zellen/ml) oder 220 μl plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs) (in einer Konzentration von 100.000 bis 500.000 Zellen/ml) mit 30 μl infizierten T-Zellen (verdünnt auf 10⁶ Zellen/ml) pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
3. Inkubieren Sie die Co-Kulturen bei 37 °C und 5 % CO₂ für 18-22 Stunden und überführen Sie sie dann auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden. 5 min bei 400 x g zentrifugieren.
4. Geben Sie 20 μl Co-Kultur-Überstand in doppelter Ausführung in jede Vertiefung. Jede Platte erfordert außerdem eine Reihe interner Standardkontrollen (humanes IFNα, Endkonzentration von 100 U/ml bis 2.500 U/ml). Die Platten bei 37 °C und 5 % CO₂ 18-22 h inkubieren.
5. Bestimmen Sie die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit der QUANTI-Blue-Lösung, die in Gegenwart des Enzyms von rosa zu violett/blau wechselt. Bereiten Sie QUANTI-Blue gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu. Geben Sie 180 μl dieser Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. In jede Vertiefung geben Sie außerdem 20 μl der induzierten HEK-Blue IFN-α/β-Zellüberstände und inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C-Inkubator, bis sich in den Standard-IFN-Kontrollvertiefungen Farbe entwickelt.
6. Evaluierung des SEAP-Spiegels mit einem Spektralphotometer bei 620-655 nm und Bestimmung der Konzentration von Typ-I-IFN durch Extrapolation aus dem linearen Teil der IFN-Standardkurve.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MT4-Zellen	NIH AIDS-Reagenzienprogramm	Nr. 120	Dieses Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 von Dr. Douglas Richman erhalten.
HEK-Blu IFN-α/β Reporterzellen	Invivogen	HKB-IFNAB
RPMI	Wisent	350-000-CL
DMEM	Wisent	319-005-CL
FBS	Wisent	080-150
PHA-L	Sigma-Aldrich	Nr. O2769
CD4+ T-Zell-Isolationskit II	Myltenyi	Tel.: 130-091-155
Diamant-Plasmazytoid-Isolationskit für dendritische Zellen II	Myltenyi	Tel.: 130-097-240
QUANTI-Blau	Zedernlan	REP-QB2
2,5 mg/ml humanes IgG	Sigma-Aldrich	I 4506