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>1. Messung von bioaktivem Typ-I-IFN mit HEK-Blue IFN-α/β Reporterzellen.
Hinweis: Diese Zellen wurden durch stabile Transfektion von HEK293-Zellen mit den humanen Genen STAT2 und IRF9 erzeugt, um einen vollständig aktiven Typ I IFN-Signalweg zu erhalten. Sie enthalten auch das sezernierte Reportergen für alkalische Phosphatase (SEAP), das vom IFN-α/β-induzierbaren ISG54-Promotor kontrolliert wird. Die Stimulation dieser Zellen mit Typ-I-IFN aktiviert den JAK/STAT/ISGF3-Signalweg und induziert die Produktion von SEAP.
- Halten Sie HEK-Blue IFN-α/β-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Plattieren Sie sie mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden und einem Endvolumen von 180 μl.
- Mischen Sie 220 μl PBMC (verdünnt auf 850.000 Zellen/ml) oder 220 μl plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs) (in einer Konzentration von 100.000 bis 500.000 Zellen/ml) mit 30 μl infizierten T-Zellen (verdünnt auf 106 Zellen/ml) pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
- Inkubieren Sie die Co-Kulturen bei 37 °C und 5 % CO2 für 18-22 Stunden und überführen Sie sie dann auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden. 5 min bei 400 x g zentrifugieren.
- Geben Sie 20 μl Co-Kultur-Überstand in doppelter Ausführung in jede Vertiefung. Jede Platte erfordert außerdem eine Reihe interner Standardkontrollen (humanes IFNα, Endkonzentration von 100 U/ml bis 2.500 U/ml). Die Platten bei 37 °C und 5 % CO2 18-22 h inkubieren.
- Bestimmen Sie die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit der QUANTI-Blue-Lösung, die in Gegenwart des Enzyms von rosa zu violett/blau wechselt. Bereiten Sie QUANTI-Blue gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu. Geben Sie 180 μl dieser Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. In jede Vertiefung geben Sie außerdem 20 μl der induzierten HEK-Blue IFN-α/β-Zellüberstände und inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C-Inkubator, bis sich in den Standard-IFN-Kontrollvertiefungen Farbe entwickelt.
- Evaluierung des SEAP-Spiegels mit einem Spektralphotometer bei 620-655 nm und Bestimmung der Konzentration von Typ-I-IFN durch Extrapolation aus dem linearen Teil der IFN-Standardkurve.