Eine Technik zur Erzeugung von Influenzavirus-ähnlichen Partikeln über ein Säugetiersystem

Zusammenfassung

Quelle: Arevalo, M. T., et al.Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Impfung. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Erzeugung von Influenzavirus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in einem Säugetiersystem. Nach der Expression von drei eukaryotischen Expressionsvektoren – die für verschiedene virale Strukturproteine kodieren – in geeigneten Säugetier-Wirtszellen ordnen sich die exprimierten viralen Proteine auf der Plasmamembran des Wirts selbst zu VLPs an und werden durch Knospung von der Zelloberfläche freigesetzt.

Protokoll

>1. Säugetier-Expressionssystem zur Erzeugung von Influenza H3N2 VLP

1. Subklonieren Sie die viralen strukturellen Glykoproteine Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und das humane Immundefizienzvirus (HIV) Gag (gruppenspezifisches Antigen) p55 in eukaryotische Expressionsvektoren, wie z. B. das zuvor beschriebene pTR600.
2. Amplifizieren Sie DNA in chemisch kompetenten Escherichia coli (z. B. DH5α) und isolieren Sie Plasmide in Transfektionsqualität mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Menge an DNA hängt vom Ertrag und den Bedürfnissen des Nutzers ab.
3. Die Säugetierzelllinie 293T wird in einem Wachstumsmedium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator aufbewahrt.
4. Züchten Sie Zellen so, dass ein T-150-Gewebekulturkolben 45-75 x 10⁶ Zellen pro Kolben enthält, so dass der Kolben am nächsten Tag eine vollständige Zelladhärenz und eine Zellkonfluenz von 85-95 % erreicht. Untersuchen Sie Zellen unter dem Mikroskop auf die gewünschte Konfluenz.
   Anmerkung: Bei der Verwendung kommerzieller Transfektionsreagenzien wird in der Regel eine hohe Zelldichte empfohlen, um eine optimale Proteinexpression mit minimaler Zytotoxizität zu erzielen. Eine Überkonfluenz kann jedoch zu einer Akkumulation von zellulären Abfallnebenprodukten führen und die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
5. Am Tag der Transfektion wird ein Liposomen-DNA-Gemisch gemäß den Empfehlungen des Herstellers hergestellt und DNA-Zellen mit einer DNA-Zusammensetzung von 1:1:2 HA:NA:Gag mit einer Gesamt-DNA-Menge von 40 μg pro T-150-Kolben transfiziert. DNA- und Liposomenlösungen in serumfreien Transfektionsmedien ohne Antibiotika so verdünnen, dass jeder Kolben ein Gesamtvolumen von 20-30 ml
   Anmerkung: Das Verhältnis der Genkonstrukte kann eine Optimierung durch den Benutzer erfordern. Obwohl hier nicht gezeigt, wurde ein ähnliches Transfektionsverfahren mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus (RSV) F und HIV Gag im Verhältnis 1:1 durchgeführt. Für DENV- und CHIKV-Einzelexpressionsplasmide werden insgesamt 20 μg DNA pro T-150-Kolben für eine optimale Expression verwendet. Das Verhältnis von DNA:Transfektionsreagenzien ist benutzeroptimiert. Verwenden Sie das empfohlene Transfektionsmedium auf der Grundlage der Transfektionsmethode, d.h. polykationische Lipidtransfektionen empfehlen eine Reduktion oder Abwesenheit von fötalem Rinderserum, so dass das Medium mit Wachstumshormonen und Spurenelementen ergänzt werden kann, um das Wachstum in Abwesenheit von Serum zu unterstützen.
6. Kolben mit 5 % CO₂ -Inkubator auf 37 °C zurückstellen. Für ein Volumen von 200 ml verwenden Sie 9 T-150 Kolben. Die Zellen werden bis zum Tag der VLP-Ernte in einem Transfektionskulturmedium aufbewahrt.
7. Ernten Sie den Kulturüberstand aus den Zellen nach 72-96 Stunden nach der Transfektion, abhängig vom Antigen oder wenn die Zellviabilität auf 70-80 % gesunken ist, wie durch mikroskopische Untersuchung geschätzt. Überstand in konische 50-ml-Röhrchen überführen und die Zellen 5 min lang bei 4 °C bei 500 × g abdrehen, um Zelltrümmer zu pelletieren.
   Hinweis: Der Austausch des 3-Tage-Überstands durch frisches, vorgewärmtes, serumfreies Transfektionsmedium für adhärente Zellen führt zu einer zweiten Charge von VLPs mit ähnlicher oder leicht reduzierter Ausbeute und sollte vom Benutzer optimiert werden.
8. Beckenüberstand und Filtrierung durch eine 0,22 μm Porenmembran vor der Sedimentation durch Ultrazentrifugation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	Artikel-Nr.: 12163
DMEM	Cellgro	Nr. 10-013
Lipofectamin	Lebenstechnologien	L3000075	Lipofectamin 2000, Lipofectamin 3000
Opti-MEM I	Lebenstechnologien	31985062
Cimarec I 6 Mehrpunkt-Rührplatte	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear Ultrazentrifugenröhrchen	Seton	7025
0,22 μm Vakuumfilter oben (500 mL)	Nalgene	Tel.: 569-0020
Glycerin	Sigma	Nr. G5516