Erzeugung von Chikungunya-Virus-ähnlichen Partikeln unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems in Insektenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Arevalo, M. T. et al., Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln für die Impfung.J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt, wie virusähnliche Partikel, VLPs, durch die Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus erzeugt werden, das die Chikungunya-Virus-Genkassette trägt. Das rekombinante Virus infiziert Zellen, was zur Bildung, Assemblierung und Freisetzung von VLP in das Kulturmedium für eine mögliche Verwendung in der Impfstoffproduktion führt.

Protokoll

>1. Expression von Chikungunya-Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) unter Verwendung des Baculovirus/Insektenzellsystems

1. Generierung von rekombinanten Baculovirus-exprimierenden Kapsid- und Hüllproteinen des Chikungunya-Virus (C-E3-E2-6K-E1) aus dem S-27-Stamm unter Verwendung eines kommerziellen Baculovirus-Expressionssystems.
2. Kultivieren Sie Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen in serumfreiem Sf9-Wachstumsmedium mit 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin bei 28 °C. Verwenden Sie 3-5 x 10⁵ c/ml, um Spinnerkolbenkulturen für das Wachstum der Suspensionszellen zu initiieren. Routinemäßige Passage bei Erreichen einer Zelldichte von 2-4 x 10⁶ c/ml (alle 3-4 Tage).
3. Kultivieren Sie Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerkolben unter Rühren bei 130 U/min auf einem Mehrpunkt-Rührplattensystem. Für eine ordnungsgemäße Belüftung halten Sie das Kulturvolumen auf nicht mehr als der Hälfte des Volumens des Spinnerkolbens.
4. Für die Expression von Chikungunya- oder CHIK-VLPs werden Sf9-Zellen mit einer Dichte von 2 x 10⁶ Zellen/ml mit rekombinanten Baculoviren bei einer Infektionsmehrheit von 1 infiziert und in den 28 °C-Inkubator zurückgeführt. Infizieren Sie in der Regel ein oder zwei Spinnerkolben, die 250 ml Sf9-Zellen enthalten.
   Anmerkung: Obwohl wir diese Methode nicht anwenden, können Sf9-Zellen in Shaker-Flaschen bei 28 °C unter Verwendung einer Shaker-Plattform kultiviert werden.
5. Ernten Sie Kulturen nach 72-96 Stunden nach der Infektion oder wenn die Zellviabilität auf 70-80 % gesunken ist, wie durch Trypanblau-Ausschluss gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt.
   Anmerkung: Die Zellen vermehren sich weiter, während sie infiziert sind, und es gibt eine Lebensfähigkeit von ~80% in Sf9-Kulturen, die mit rekombinantem CHIK VLP-Baculovirus infiziert sind, 3 Tage nach der Infektion (dpi). Baculovirus-infizierte Zellen sehen größer aus. Die Morphologie kann sich auch von rund bis länglich ändern. In den späten Stadien der Baculovirus-Infektionen begannen die Zellen zu lysieren.
6. Die Kulturen direkt aus der Suspensionskultur in konische 50-ml-Röhrchen überführen und die Zellen 5 min lang bei 4 °C bei 500 x g herunterschleudern.
7. Überstände auffangen und durch eine 0,22 μm Porenmembran filtrieren, bevor die Sedimentation durch Ultrazentrifugation erfolgt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Opti-MEM I	Lebenstechnologien	31985062
Bac-zu-Bac-Baculovirus-Expressionssystem	Lebenstechnologien	Tel.: 10359-016
0,22 μm Vakuumfilter oben (500 mL)	Nalgene	Tel.: 569-0020
SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	Tel.: 10902-096
Cimarec I 6 Mehrpunkt-Rührplatte	ThermoFisher Scientific	50094596