Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Umgang mit Tieren, Vorbereitung und Induktion von Entzündungen
- Verwenden Sie 4 - 6 Wochen alte männliche Mäuse mit einem Gewicht von 16 - 20 g. Hinweis: Wenn die Mäuse älter oder schwerer sind, weisen sie übermäßiges Fett auf, das das Gefäß umgibt, was die mikroskopische Beobachtung einschränkt.
- Sterilisieren Sie alle Werkzeuge und den Mikroskoptisch vor der Operation.
- Injizieren Sie 4 Stunden vor der Mikroskopie intraperitoneal 20 mg/kg LPS (Lipopolysaccharid) in die lebende Maus, um eine bakterielle Entzündung auszulösen.
- Eine 0,9%ige Kochsalzlösung in einem Wasserbad bei 37 °C vorwärmen, um die Kunststoffkammer und das Mesenterialgewebe zu befeuchten.
- Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) unmittelbar vor dem Mikroskopieverfahren. Es kann eine alternative Anästhesie verwendet werden, z. B. eine 2%ige Isofluran-Inhalation. Bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie durch den Verlust der Reaktion auf die Reflexstimulation (Zehen- oder Schwanzkneifen mit festem Druck).
- Enthaaren Sie den Bauch mit einem Rasierer und entfernen Sie lose Haare mit Gaze, die mit Ethanol 70% gesättigt ist.
- Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit zu verhindern, während sie unter Narkose steht.
>2. Chirurgie
- Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Diese Methode ist keine sterile Methode und könnte am Ende des Experiments tödlich sein.
- Führen Sie eine mediane Laparotomie durch: Öffnen Sie die Bauchhaut mit einer kleinen, gebogenen Pinzette und einer kleinen Schere. Identifizieren Sie die epigastrischen Gefäße und öffnen Sie das Bauchfell im Bereich der Linea alba, um die Gefäße zu schützen.
- Tragen Sie ein paar Tropfen vorgewärmte Kochsalzlösung in die Bauchhöhle auf, um das Gewebe feucht zu halten.
- Markieren Sie Leukozyten und Blutplättchen fluoreszierend durch retroorbitale Injektion von 50 μl Rhodamin 6G (1 mg/ml).
- Nehmen Sie eine Ileumschleife nach außen und legen Sie sie in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm; achten Sie darauf, das Gewebe feucht zu halten, indem Sie alle zwei Minuten die auf 37 °C vorgewärmte Kochsalzlösung (0,9%) auftragen.
>3. Intravitale Mikroskopie
- Platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop und bringen Sie die Mesenterialvene mit einem Durchmesser von 200 - 300 μm in die Bildmitte. Wählen Sie ein Gefäß ohne sichtbare Fettumgebung.
- Berühren Sie nicht die Mesenteriengefäße, um eine Stimulation des Endothels zu vermeiden. Behandeln Sie die Ileumschlaufe vorsichtig.
- Visualisieren Sie Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel mit einem inversen oder aufrechten Mikroskop und einer Kamera mithilfe einer Mikroskopsoftware. Erfassen Sie die Wechselwirkungen zwischen Blutzellen und Endothel für 1 Minute in 4 verschiedenen Venen pro Maus.
- Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation nach Abschluss der bildgebenden Experimente.
>4. Analyse
- Führen Sie die Analyse offline und blind für alle Parameter durch. Führen Sie die Analyse mit einem geeigneten Softwareprogramm durch.
- Bestätigen Sie stabile und interindividuell vergleichbare Blutflussbedingungen in zeitaufgelösten Cine-Clips (maximale Bildrate), die sich auf den intraluminalen Blutzellfluss konzentrieren.
- Quantifizieren Sie die Anzahl der rollenden Leukozyten. Ziehen Sie daher eine vertikale Linie durch die Vene und zählen Sie alle Leukozyten, die diese Linie kreuzen, in 1 min.
- Bestimmen Sie die Rollgeschwindigkeit, indem Sie die Zeit messen, die ein einzelner Leukozyt benötigt, um eine Strecke von 50 μm zu überwinden, während er stabil auf dem Endothel rollt. Ziehen Sie dazu zwei senkrechte Linien in einem Abstand von 50 μm durch die Vene.
- Messen Sie die Zeit, die ein repräsentativer Leukozyt benötigt, um von einer Linie zur anderen zu gelangen. Berechnen Sie die Geschwindigkeit der Leukozyten, indem Sie 50 μm durch die benötigte Zeit (μm/s) dividieren.
- Messen Sie die Leukozytenadhäsion in einem Feld von 0,04 mm2. Ziehen Sie dazu ein Quadrat mit einer Seitenlänge von 200 μm in die Vene.
- Zählen Sie die fest anhaftenden Leukozyten, definiert als keine sichtbare Bewegung für 30 Sekunden, innerhalb dieses Quadrats.
- Zählen Sie die Anzahl der an einen Leukozyten gebundenen Blutplättchen, um die Thrombozyten-Leukozyten-Wechselwirkungen zu quantifizieren.
