$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Antigenpräparat für die subkutane Injektion
- Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt in einem chemischen Abzug durch, um das Einatmen oder den Hautkontakt mit dem Mtb H37Ra-Pulver Mycobacterium tuberculosis zu verhindern. Behandeln Sie gemäß Ihren institutionellen Richtlinien für Complete Freund's Adjuvans (typischerweise BSL-1). Dazu gehört die Verwendung von chemikalienbeständigen Handschuhen, einer Schutzbrille und Arbeitsschutzkleidung (Laborkittel).
- Verwenden Sie eine gute sterile Technik, um eine Kontamination von Reagenzien zu verhindern, die in Versuchstiere eingeführt werden.
- Stellen Sie die Mtb-Suspension in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) her, indem Sie 5 mg lyophilisiertes, hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis H37Ra-Pulver mit 2,5 ml kaltem PBS in einem 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Einmal 30 Sekunden lang vortexen und dann auf Eis legen.
- Um eine feine Suspension des H37Ra in PBS zu erzeugen, beschallen Sie die Suspension 5 min lang auf Eis.
- Lösen Sie den Körper der Konvertereinheit und reinigen Sie die Sonde mit einem 70%igen (v/v) Alkoholtupfer.
- Schalten Sie das Ultraschallgerät ein, stellen Sie die Leistungsstufe durch Drehen des Leistungsreglers auf 4 ein und tauchen Sie die Spitze der Sonde in das PBS-haltige mykobakterielle Pulver. Stellen Sie sicher, dass die Sondenspitze mindestens bis zur Hälfte der Tiefe der Probe eingetaucht ist und dass die Sondenspitze die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens nicht berührt.
- Beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang auf Eis, pausieren Sie sie 30 Sekunden lang und wiederholen Sie den Vorgang insgesamt 5 Minuten, um das Pulver vollständig in eine gleichmäßige Suspension zu verteilen, ohne die Flüssigkeit zu erhitzen.
- Fügen Sie der Mischung 2,5 ml Freund's Incomplete Adjuvans hinzu und wiederholen Sie den Ultraschallprozess auf Eis, bis die Emulsion eine zahnpastaähnliche Konsistenz bildet.
- Stellen Sie die Leistung mit dem Drehknopf auf 0 und schalten Sie das Gerät aus, um die Beschallung zu beenden. Entfernen Sie die Spitze aus der Suspension und wischen Sie die Sonde mit einem Alkoholtupfer ab.
- Lagern Sie die Antigenemulsion bei 4 °C. Die Herstellung von Chargen der Emulsion trägt dazu bei, die Konsistenz der Experimente zu gewährleisten. Die Emulsion kann bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden.
>2. Subkutane Injektion
- Führen Sie die subkutane Injektion eine Woche vor der intravitrealen Injektion durch (bezeichnet als Tag -7).
- Laden Sie eine 1-ml-Spritze (ohne Nadel) mit der mykobakteriellen Emulsion. Aufgrund der Viskosität und Opazität der Emulsion können schwer sichtbare Luftblasen die Spritze füllen.
- Um Luftblasen in der Spritze zu vermeiden, drehen Sie die Spritze nach dem Laden von 0,2-0,3 ml Emulsion um (Spitze nach oben) und klopfen Sie mit der Spritze wiederholt vorsichtig auf den Rand einer Theke, um die Blasen an die Oberfläche zu bringen.
- Stoßen Sie die Luft aus der Spritze aus und fahren Sie mit dem Befüllen der Spritze fort. Invertieren und intermittierend klopfen, bis es gefüllt ist.
- Legen Sie eine 25-G-Nadel auf die Spritze und schieben Sie die Emulsion vor, um die Nadel zu füllen. Bewahren Sie die Spritze bis zur Verwendung auf Eis auf.
- Um die subkutane Injektion sicher durchzuführen, betäuben Sie entweder die Maus oder verwenden Sie humane Fixierungsmethoden, die einen einfachen Zugang zur Hinterhand des Tieres ermöglichen.
- Um die subkutane Injektion zu betäuben, legen Sie das Tier in eine Isofluran-Induktionskammer (3%-4% für die Induktion und 1%-3% für die Erhaltung). Stellen Sie nach der Betäubung sicher, dass die Maus eine langsame Atemfrequenz hat und keine Anzeichen von Atemnot zeigt.
- Platzieren Sie die subkutanen Injektionen entweder auf der dorsalen Oberfläche der Hüften oder auf der ventralen Oberfläche der Beine proximal zum Bereich der leistenförmigen Lymphknoten.
- Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, um eine Injektion in den Muskel zu verhindern. Injizieren Sie 0,05 ml der Mtb-Emulsion in den subkutanen Raum. Entfernen Sie die Nadel nicht sofort, um die dicke Emulsion vollständig injizieren zu können.
- Wiederholen Sie die Injektion auf der linken und rechten Seite für insgesamt 0,1 ml pro Tier.
- Wenn Sie betäubt sind, legen Sie die Maus bis zur vollständigen Genesung auf ein warmes Heizkissen. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
- Setzen Sie die Maus nach vollständiger Genesung wieder in ihren Käfig ein und beschriften Sie die Käfigkarte mit dem Datum der subkutanen Injektion.
- Geben Sie Analgesie mit oralem Paracetamol (200 mg/kg/Tag), jedoch nicht mit nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs), da entzündungshemmende Mittel die Induktion von Uveitis beeinflussen können.