Ein Mausmodell der geprimten mykobakteriellen Uveitis zur Untersuchung der postinfektiösen Uveitis

Zusammenfassung

Quelle: John, S., et al. Vorbereitete mykobakterielle Uveitis (PMU) als Modell für postinfektiöse Uveitis. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Generierung eines Mausmodells der geprimten mykobakteriellen Uveitis (PMU) zur Untersuchung der postinfektiösen Uveitis. Bei der Induktion von PMU durch intravitreale Injektion von hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis bei einer Maus, die zuvor mit demselben Immungen immunisiert wurde, wird das Fortschreiten der chronischen Entzündung im Auge mittels Bildgebung und histopathologischer Untersuchung analysiert

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Antigenpräparat für die subkutane Injektion

1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt in einem chemischen Abzug durch, um ein Einatmen oder einen Hautkontakt mit dem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra-Pulver zu verhindern. Behandeln Sie gemäß Ihren institutionellen Richtlinien für Complete Freund's Adjuvans (typischerweise BSL-1). Dazu gehört die Verwendung von chemikalienbeständigen Handschuhen, einer Schutzbrille und Arbeitsschutzkleidung (Laborkittel).
2. Verwenden Sie eine gute sterile Technik, um eine Kontamination von Reagenzien zu verhindern, die in Versuchstiere eingeführt werden.
3. Stellen Sie die Mtb-Suspension in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) her, indem Sie 5 mg lyophilisiertes, hitzeabgetötetes Mtb H37Ra-Pulver mit 2,5 ml kaltem PBS in einem 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Einmal 30 Sekunden lang vortexen und dann auf Eis legen.
4. Um eine feine Suspension des H37Ra in PBS zu erzeugen, beschallen Sie die Suspension 5 min lang auf Eis.
   1. Lösen Sie den Körper der Konvertereinheit und reinigen Sie die Sonde mit einem 70%igen (v/v) Alkoholtupfer.
   2. Schalten Sie das Ultraschallgerät ein, stellen Sie die Leistungsstufe durch Drehen des Leistungsreglers auf 4 ein und tauchen Sie die Spitze der Sonde in das PBS-haltige mykobakterielle Pulver. Stellen Sie sicher, dass die Sondenspitze mindestens bis zur Hälfte der Tiefe der Probe eingetaucht ist und dass die Sondenspitze die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens nicht berührt.
5. Beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang auf Eis, pausieren Sie sie 30 Sekunden lang und wiederholen Sie den Vorgang insgesamt 5 Minuten, um das Pulver vollständig in eine gleichmäßige Suspension zu verteilen, ohne die Flüssigkeit zu erhitzen.
6. Fügen Sie der Mischung 2,5 ml Freund's Incomplete Adjuvans hinzu und wiederholen Sie den Ultraschallprozess auf Eis, bis die Emulsion eine zahnpastaähnliche Konsistenz bildet.
7. Stellen Sie die Leistung mit dem Drehknopf auf 0 und schalten Sie das Gerät aus, um die Beschallung zu beenden. Entfernen Sie die Spitze aus der Suspension und wischen Sie die Sonde mit einem Alkoholtupfer ab.
8. Lagern Sie die Antigenemulsion bei 4 °C. Die Herstellung von Chargen der Emulsion trägt dazu bei, die Konsistenz der Experimente zu gewährleisten. Die Emulsion kann bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden.

>2. Subkutane Injektion

1. Führen Sie die subkutane Injektion eine Woche vor der intravitrealen (IVT) Injektion durch (bezeichnet als Tag -7).
2. Laden Sie eine 1-ml-Spritze (ohne Nadel) mit der mykobakteriellen Emulsion. Aufgrund der Viskosität und Opazität der Emulsion können schwer sichtbare Luftblasen die Spritze füllen.
   1. Um Luftblasen in der Spritze zu vermeiden, drehen Sie die Spritze nach dem Laden von 0,2-0,3 ml Emulsion um (Spitze nach oben) und klopfen Sie mit der Spritze wiederholt vorsichtig auf den Rand einer Theke, um die Blasen an die Oberfläche zu bringen.
3. Stoßen Sie die Luft aus der Spritze aus und fahren Sie mit dem Befüllen der Spritze fort. Invertieren und intermittierend klopfen, bis es gefüllt ist.
4. Legen Sie eine 25-G-Nadel auf die Spritze und schieben Sie die Emulsion vor, um die Nadel zu füllen. Bewahren Sie die Spritze bis zur Verwendung auf Eis auf.
5. Um die subkutane Injektion sicher durchzuführen, betäuben Sie entweder die Maus oder verwenden Sie humane Fixierungsmethoden, die einen einfachen Zugang zur Hinterhand des Tieres ermöglichen.
6. Um die subkutane Injektion zu betäuben, legen Sie das Tier in eine Isofluran-Induktionskammer (3%-4% für die Induktion und 1%-3% für die Erhaltung). Stellen Sie nach der Betäubung sicher, dass die Maus eine langsame Atemfrequenz hat und keine Anzeichen von Atemnot zeigt.
7. Platzieren Sie die subkutanen Injektionen entweder auf der dorsalen Oberfläche der Hüften oder auf der ventralen Oberfläche der Beine proximal zum Bereich der leistenförmigen Lymphknoten.
   1. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, um eine Injektion in den Muskel zu verhindern. Injizieren Sie 0,05 ml der Mtb-Emulsion in den subkutanen Raum. Entfernen Sie die Nadel nicht sofort, um die dicke Emulsion vollständig injizieren zu können.
   2. Wiederholen Sie die Injektion auf der linken und rechten Seite für insgesamt 0,1 ml pro Tier.
8. Wenn Sie betäubt sind, legen Sie die Maus bis zur vollständigen Genesung auf ein warmes Heizkissen. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
9. Setzen Sie die Maus nach vollständiger Genesung wieder in ihren Käfig ein und beschriften Sie die Käfigkarte mit dem Datum der subkutanen Injektion.
10. Geben Sie Analgesie mit oralem Paracetamol (200 mg/kg/Tag), aber nicht mit nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAIDs), da entzündungshemmende Mittel die Induktion von Uveitis beeinflussen können.

>3. Antigen-Stammvorbereitung für die intravitreale Injektion

1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter geeigneten sterilen Bedingungen durch, um eine Kontamination der intravitrealen Mtb-Suspension zu verhindern.
2. Stellen Sie die intravitrealen Suspensionen her.
   1. Zur Induktion einer leichten bis mittelschweren Panuveitis stellen Sie die intravitreale Suspension in einer Konzentration von 5 mg/ml her, indem Sie 5 mg des Mykobakterienextrakts zu 1 ml 1x PBS hinzufügen.
   2. Zur Induktion einer mittelschweren bis schweren Panuveitis stellen Sie die intravitreale Suspension in einer Konzentration von 10 mg/ml her, indem Sie 10 mg des Mykobakterienextrakts zu 1 ml 1x PBS hinzufügen.
3. Einmal 30 Sekunden lang vortexen und dann auf Eis legen.
4. Um eine feine Suspension des H37Ra in PBS zu erzeugen, beschallen Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Diese Stammlösung wird in einem Volumen von 100 μl aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
5. Vor der Verwendung bei Raumtemperatur auftauen und 1 Minute lang auf hoher Stufe wirbeln. Bewahren Sie die Aliquots auf Eis auf, während Sie sie zur Tierhaltung transportieren.

>4. Intravitreale Injektion am Tag 0

1. Zubereitung von Tieren
   1. Tragen Sie eng anliegende Untersuchungshandschuhe und stellen Sie die Maus auf eine Waage, um ihr Gewicht in Gramm zu ermitteln.
   2. Geben Sie eine intraperitoneale Injektion von 0,02 ml/g Körpergewicht einer Lösung, die 100 mg/ml Ketamin und 20 mg/ml Xylazin enthält, gemischt mit sterilem Wasser, um das Tier zu betäuben. Ein alternativer Ansatz beinhaltet die Induktion mit ~1,5% Isofluran (inhaliert).
   3. Warten Sie ca. 2 Minuten, bis die Maus eingeschlafen ist, und legen Sie die Maus dann in eine Warmhaltebox und decken Sie den Deckel ab. Führen Sie Schmerzreflextests wie Ohr-, Zehen- und Schwanzkneifen durch, um die Tiefe der Anästhesie für den Eingriff zu beurteilen.
   4. Sobald Sie eingeschlafen sind, betäuben Sie die Hornhaut mit 1 Tropfen 0,5% (v/v) Tetracain. Vermeiden Sie es, Tetracain in die Nähe der Nase oder des Mundes der Maus zu bekommen. Nach 10 s tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.
      Anmerkung: Es wurde beobachtet, dass die Iriserweiterung und die Visualisierung der Vorderkammer (AC) verbessert werden, wenn eine topische Anästhesie verabreicht wird, möglicherweise aufgrund einer verbesserten Unterdrückung des Hornhautreflexes mit der kombinierten systemischen und topischen Anästhesie. Dieser Schritt kann jedoch auf Wunsch entfallen.
   5. Erweitern Sie die Pupille mit 1 Tropfen 2,5 % (v/v) Phenylephrin. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Tröpfchen zu vermeiden, die in die Nase oder den Mund gelangen könnten. Nach 2-3 min die überschüssige Flüssigkeit abtupfen.
   6. Um das Risiko einer Endophthalmitis zu verringern, geben Sie 1 Tropfen 5% Betadin auf die Augenoberfläche und das umgebende Haar. 2-3 Min. auf dem Auge einwirken lassen< /> Anmerkung: Führen Sie alle Eingriffe in diesem Abschnitt unter geeigneten sterilen Bedingungen durch, um eine Endophthalmitis zu verhindern.
   7. Entfernen Sie Betadin und bedecken Sie das Auge mit Hypromellose (0,3 %) oder Carbomer-Augengel 0,2 % w/w), um Trockenheit unter Narkose zu verhindern. Dies hilft auch, die Bildung von Katarakten zu verhindern.
2. Einrichten des Mikroinjektionssystems
   1. Führen Sie die intravitreale Injektion mit einer Mikropumpe durch, die mit einer Mikrospritzenpumpensteuerung und einer Injektionsspritze verbunden ist (Abbildung 1A-C). Alternativ kann die Injektion mit einer 33-G-Nadel erfolgen, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist, wie in Unterabschnitt 4.4 beschrieben.
   2. Verbinden Sie eine 34-G-Nadel mit dem Injektionshalter, um den Injektor zu montieren. Lösen Sie den silbernen Schraubverschluss am vorderen Ende des Injektionshalters und schieben Sie die Nadel etwa zur Hälfte in den Körper des Halters. Ziehen Sie den silbernen Schraubverschluss mit den Fingern fest.
   3. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Injektionshalter, wie in den Schritten 4.2.4 bis 4.2.5 beschrieben.
   4. Um den Schlauch auf den Injektionshalter zu setzen, lösen Sie die Kunststoffschraube am hinteren Ende des Halters, schieben Sie den Schlauch durch die Dichtung im Inneren und ziehen Sie die Schraube fest.
   5. Halten Sie einen leichten Spalt am Ende des Schlauchs ein, um eine Beschädigung des Schlauchs während der Injektion zu vermeiden. Siehe Abbildung 1C.
   6. Tauen Sie ein 100 μl aliquotes der Mycobacterium-Stammsuspension auf.
   7. 3 μl einer 1%igen Fluorescein-Natrium-Lösung (AK-Fluor) zugeben und gut vortexen.
   8. Laden Sie eine 10-μl-Spritze mit dem Antigen-Fluorescein-Gemisch ohne Luftblasen.
   9. Entfernen Sie die Ladenadel von der Spritze und schieben Sie den Schlauch durch die silberne Schraubverschlussdichtung, bis die Spitze die Nullmarkierung im Spritzenkörper erreicht.
   10. Sobald die Spitze des Schlauchs korrekt in der gewünschten Position ausgerichtet ist, ziehen Sie den Schraubverschluss fingerfest fest.
   11. Spülen Sie die Lösung in der Spritze durch den Injektionsschlauch, um das System vollständig zu befüllen. Wiederholen Sie dann die Schritte 4.2.8-4.2.11, um die Injektionsspritze wieder zu laden.
   12. Um die geladene Spritze an der Mikropumpe zu installieren, drücken Sie den Entriegelungsknopf am Ende der Mikropumpe, um die Spritzenklemmen zu öffnen.
   13. Setzen Sie die Kappe des Kolbens in den Kolbenkappenhalter am hinteren Ende der Mikropumpe ein.
   14. Schieben Sie dann den Spritzenkragen auf den Kragenanschlag und den Spritzenkörper in die Spritzenklemme.
   15. Lassen Sie den Klemmknopf los und ziehen Sie die Halteschraube des Stößels fest. Siehe Abbildung 1D.
   16. Schieben Sie den Injektionshalter und die Nadel durch die O-Klemme an der stereotaktischen Injektionsvorrichtung. Dies ist eine benutzerdefinierte Plattform; Alternativ kann die Spritze auch manuell gehalten und positioniert werden.
   17. Stellen Sie das Infusionsvolumen und die Infusionsvolumenrate an der Steuerung der Mikrospritzenpumpe so ein, dass 500 nL pro Zyklus bei einer Rate von 40 nL/s injiziert werden.
       Anmerkung: Schnellere Injektionsraten können verwendet werden, es kann jedoch zu einem stärkeren Rückfluss kommen, bevor eine Neupositionierung der Nadel erreicht werden kann.
   18. Testen Sie das System, um sicherzustellen, dass es korrekt funktioniert, bevor Sie eine intravitreale Injektion durchführen.
       Anmerkung: Wenn das Einspritzsystem ordnungsgemäß funktioniert, bewirkt die Aktivierung eines Einspritzzyklus mit dem Fußpedal oder dem Steuerkreuz eine sichtbare Bewegung des Kolbenkappenhalters, und an der Spitze der Nadel ist ein kleines Tröpfchen grünlicher Flüssigkeit zu sehen. Falls keine Flüssigkeit produziert wird, aktivieren Sie zusätzliche Zyklen oder spülen Sie die Spritze und laden Sie sie neu.
   19. Wischen Sie die Nadel vor der Injektion des Auges vorsichtig mit einem 95%igen Ethanol-Pad ab.
3. Verfahren der intravitrealen Injektion
   1. Die Maus wird auf eine stereotaktische Vorrichtung gelegt, um den Injektionsvorgang durchzuführen.
   2. Halten Sie die Bühne/Plattform, auf der die Maus ruht, warm, indem Sie 2-3 Papiertücher auf ihrer Oberfläche anbringen.
   3. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf der Plattform. Verwenden Sie den rechten und linken Ohrbügel, um den Kopf des Tieres vorsichtig zu fixieren. Siehe Abbildung 1E.
   4. Positionieren Sie die Maus und richten Sie sie unter dem Zielfernrohr so aus, dass der obere nasale Aspekt des rechten Auges sichtbar ist.
   5. Verwenden Sie eine 30 g Nadel, um die Wimpern zu verschieben und die Sklera freizulegen. Visualisieren Sie den Limbus und das radiale Blutgefäß.
   6. Mit einer sterilen 30 G Nadel ein Führungsloch in die Sklera 1-2 mm hinter dem Limbus bohren.
   7. Führen Sie die am Injektionshalter befestigte 34-G-Nadel durch das Führungsloch in einem Winkel in das Auge ein, der die Linse vermeidet, aber setzen Sie die Nadelspitze in den Glaskörper ein.
   8. Injizieren Sie mit der Pumpensteuerung der Mikrospritze vorsichtig 1 μl des Mtb-Extrakts in die Glaskörperhöhle. Bei gleichbleibendem Reflux ist das Injektionsvolumen auf 1,5 μl zu erhöhen, um eine angemessene Dosisabgabe zu gewährleisten.
      Anmerkung: Zur Scheinkontrolle ist 1 μl PBS in das Auge des Tieres zu injizieren.
   9. Überprüfen Sie die intravitreale Platzierung durch Visualisierung eines grünlichen Reflexes im Auge. Siehe Abbildung 1F.
   10. Ziehen Sie nach 10 s die Nadel aus dem Öhr zurück. Achten Sie auf eventuellen Reflux.
   11. Nehmen Sie die Maus von der Plattform, geben Sie 0,3 % Hypromellose oder 0,2 % Gew.-% Carbomer-Augensalbe auf beide Augen, um die Hornhaut zu schützen, und begeben Sie sie in die Erholungs-Wärmebox.
   12. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Kehren Sie nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis Sie sich vollständig erholt haben.
   13. Wenn die Maus vollständig wach ist, kehren Sie in den Käfig zurück und fügen Sie eine medizinische Wasserflasche (200-300 mg/kg/Tag) hinzu. Beschriften Sie die Käfigkarte mit dem Datum der IVT-Injektion.
   14. Intravitreale Injektionen werden im Allgemeinen gut vertragen. Klinische Anzeichen, die auf Schmerzen und die Notwendigkeit einer Entfernung aus der Studie hinweisen können, sind periokulare Alopezie (ein Hinweis auf ein Selbsttrauma), Hornhautgeschwüre, Gewichtsverlust und gebeugte Haltung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau der intravitrealen Injektion der Maus. Die intravitreale Injektion wird am Mausauge unter Verwendung von (A) einer Mikrospritzenpumpensteuerung, die mit der (B) Mikropumpe verbunden ist, und (C) einer Injektionsspritze durchgeführt. Die Spritze wird geladen und auf die (D) Mikropumpe montiert. Der Mauskopf wird...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AK-FLUOR	Akorn Pharmaceuticals, IL, Vereinigte Staaten von Amerika		10 % Fluorescein-Natrium 100 mg/ml in einer 5-ml-Durchstechflasche
AnaSed	Akorn Animal Health, IL, USA	NDC 59399-110-20	Xylazin 20 mg/ml
Betadin 5% sterile ophthalmische Vorbereitungslösung	Alcon, TX, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. 8007-1
B-D Präzisions-Gleitnadeln -25 g	Becton, Dickinson and Company, NJ, USA	305122
B-D Precision Glide Nadel -30-G	Becton, Dickinson and Company, NJ, USA	305106
Anleihe MAX, Anleihe Rx	Leica Biosystems, IL, USA		Automatisiertes IHC-Färbesystem
Chloramphenicol Salbe	Martindale Pharma, Romford, Großbritannien		1 % w/w Chloramphenicol
EG1150H	Leica Biosystems, IL, USA		Einbettung von Gewebe
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		OCT-Maschine
Freunds unvollständiges Adjuvans	BD Difco, NJ, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 263910
GenTeal Gleitgel Augensalbe	Alcon, TX, Vereinigte Staaten von Amerika	---
GenTeal Gleitgel für die Augen	Alcon, TX, Vereinigte Staaten von Amerika	---
H37Ra lyophilisierter Mykobakterien-Extrakt	BD Difco, NJ, Vereinigte Staaten von Amerika	231141
Hamilton RN Nadel (33/12/2)S	Hamilton, Reno, Vereinigte Staaten von Amerika	7803-05(33/12/2)	33 Gramm
Hamilton Spritze	Hamilton, Reno, Vereinigte Staaten von Amerika	CAL7633-01	5 μL
Insulin-Nadel	Exel International, USA	Artikel-Nr.: 26029	1 mL
Isofluran
Ketaset	Zoetis, Vereinigte Staaten von Amerika	377341	Ketamin HCL 100 mg/ml
Mikroinjektionsspritzenpumpe und Micro4Controller	World Precision Instruments, FL, USA	UMP3
Mikron IV	Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, Kalifornien		Alternative Bildgebungs-/OCT-Maschine
Nanofil 10 μL Spritze	World Precision Instruments, FL, USA	NANOFIL
Nanofil Intraokulares Injektionskit	World Precision Instruments, FL, USA	IO-KIT
Olympus SZX10	Olymp		Umfang der Sektion
Pbs	Gibco	Artikel-Nr.: 14190
Phenylephrinhydrochlorid Ophthalmische Lösung USP 2,5% steril 15 mL	Akorn Pharmaceuticals, IL, Vereinigte Staaten von Amerika	17478020115
RM2255	Leica Biosystems, IL, USA		Gewebe-Schnitte
TB-Spritze	Becton, Dickinson and Company, NJ, USA	309602	1 mL
Tetracain 0,5%	Alcon, TX, Vereinigte Staaten von Amerika	1041544
Tissue Tek VIP-Serie	Sakura Finetek USA, Inc., Kalifornien.		Histologie Gewebeaufbereitung
Tropicamid 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Großbritannien		Minims
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc., PA, USA	NDC 50580-614-01	acetaminophen
Viscotears	Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Grossbritannien		Carbomer Augengel 0,2 % w/w