Methodenartikel

Vorbereitung und Quantifizierung von Mycobacterium bovis BCG lux Inokulum zur Infektion

8. Juli 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Asai, M. et al., Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Vorbereitung und Quantifizierung des Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux-Inokulums mittels Biolumineszenz-Assay und die Aufzählung von koloniebildenden Einheiten. Das vorbereitete Inokulum kann für Infektionsstudien verwendet werden.

Protokoll

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HINWEIS: Alle unten beschriebenen Arbeiten sind in einem CL2-Labor innerhalb einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (MSC) der Klasse 2 gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien durchzuführen.

>1. Vorbereitung von M. bovis BCG lux auf die Infektion

  1. Tauen Sie einen gefrorenen 1,2-ml-Glycerinbestand (15 %) von M. bovis BCG lux auf, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 transformiert wurde, das die luxAB-Gene von Vibrio harveyi trägt, die für das Luciferase-Enzym kodieren.
  2. 15 ml Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2 % Glycerin, 10 % Albumin, Dextrose, Katalase (ADC)-Anreicherung und 50 μg/ml Hygromycin mit einem aufgetauten 1,2 ml-Aliquot BCG lux in einem markierten 250-ml-Erlenmeyerkolben inokulieren.
  3. Der Kolben wird in einen verschlossenen Biosicherheitsbehälter gegeben und bei 37 °C in einem orbitalen Schüttel-Inkubator bei 220 U/min 72 Stunden lang inkubiert (oder bis die Kultur die mittlere Phase des Wachstums erreicht).
  4. Überprüfen Sie das Wachstum der BCG-Lux-Kultur, indem Sie 1:10-Verdünnungen der Kultur in Luminometerröhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, 0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid) in zweifacher Ausfertigung vorbereiten. Wirbeln Sie vortexen, laden Sie die Luminometerröhren in das Luminometer und messen Sie die Biolumineszenz (relative Lichteinheit [RLU]/ml) mit n-Decylaldehyd als Substrat (1 % v/v in absolutem Ethanol).
    Anmerkung: Das Verhältnis von RLU/koloniebildenden Einheiten (KBE) wurde zuvor auf 3:1 bestimmt, wenn BCG lux in vitro in Middlebrook 7H9-Brühe gezüchtet wurde.
  5. Die Kultur wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.175 x g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und der Überstand wird in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizider Wirkung abgegeben. Entsorgen Sie alle Kulturabfälle mit Desinfektionsmitteln, die für Mykobakterien gemäß den örtlichen Richtlinien geeignet sind.
  6. Waschen Sie das Zellpellet zweimal in PBS mit 0,05 % Polysorbat 80 (PBS-T), um Bakterienverklumpungen zu verhindern.
  7. Nach der letzten Wäsche wird der Überstand des Abfalls dekantiert, das mykobakterielle Zellpellet in PBS-T resuspendiert und die mykobakterielle Suspension mit RLU-Messungen auf die gewünschte Zelldichte verdünnt.
  8. Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen des Inokulums in 24-Well-Platten mit PBS-T vor. 10 μl auf Middlebrook 7H11-Agarplatten (0,5 % Glycerin, 50 μg/ml Hygromycin, 10 % Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase [OADC]) in doppelter Ausführung auffüllen, um die Anzahl der Inokulum-KBE aufzuzählen.

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Offenlegungen

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf)Eppendorf22431021
20, 200 und 1000 μl Pipette und filtrierte SpitzenJeder Lieferantn/a
24-Well-KulturplatteGreinerArtikel-Nr.: 662160
25 ml Pipetten und Pipette BoyJeder Lieferantn/a
Petrischale mit 3 Fächern (94/15mm)Greiner637102
ZentrifugeJeder Lieferantn/a
Sicherheitsschrank der Klasse IIJeder Lieferantn/a
Ethanol (>99,7 %)VWRArtikel-Nr.: 208221.321
GlycerinSigma-AldrichNr. G5150
Hygromycin BCorning30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953)BertholdArtikel-Nr.: 34622
Luminometer-RöhrenCorning352054
MikrozentrifugeJeder Lieferantn/a
Middlebrook 7H11 AgarBD BiowissenschaftenArtikel-Nr.: 283810
Middlebrook 7H9 BrüheBD BiowissenschaftenArtikel-Nr.: 271310
Middlebrook ADC-AnreicherungBD Biowissenschaften212352
Middlebrook OADC-AnreicherungBD BiowissenschaftenArtikel-Nr.: 212240
Mycobacterium bovis BCG luxverschiedenn/a
n-DecylaldehydSigma-AldrichNr. D7384-100G
Orbital-Schüttel-InkubatorJeder Lieferantn/a
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichP4417-100TAB
Polysorbat 80 (Tween-80)Sigma-AldrichNr. 8074-500ml
Erlenmeyerkolben mit belüftetem Deckel (250 ml)CorningCLS40183
Winterm (V1.08)Bertholdn/aProgramm LB953.TTB

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Schlagwörter

Biolumineszenz Assaykoloniebildende EinheitenHygromycin supplementiertes MediumSerienverd nnungenLuminometermessungMiddlebrook 7H9 Bouillonphosphatgepufferte Salzl sungZentrifugationswaschungAgarplatten Aufz hlung

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