HINWEIS: Alle unten beschriebenen Arbeiten sind in einem CL2-Labor innerhalb einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (MSC) der Klasse 2 gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien durchzuführen.
>1. Vorbereitung von M. bovis BCG lux auf die Infektion
- Tauen Sie einen gefrorenen 1,2-ml-Glycerinbestand (15 %) von Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux auf, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 transformiert wurde, das die luxAB-Gene von Vibrio harveyi trägt, die für das Luciferase-Enzym kodieren.
- 15 ml Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2 % Glycerin, 10 % Albumin, Dextrose, Katalase (ADC)-Anreicherung und 50 μg/ml Hygromycin mit einem aufgetauten 1,2 ml-Aliquot BCG lux in einem markierten 250-ml-Erlenmeyerkolben inokulieren.
- Der Kolben wird in einen verschlossenen Biosicherheitsbehälter gegeben und bei 37 °C in einem orbitalen Schüttel-Inkubator bei 220 U/min 72 Stunden lang inkubiert (oder bis die Kultur die mittlere Phase des Wachstums erreicht).
- Überprüfen Sie das Wachstum der BCG-Lux-Kultur, indem Sie 1:10-Verdünnungen der Kultur in Luminometerröhrchen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, 0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid) in zweifacher Ausfertigung vorbereiten. Drehen Sie einen Vortex, laden Sie die Luminometerröhren in das Luminometer und messen Sie die Biolumineszenz (relative Lichteinheit [RLU]/ml) mit n-Decylaldehyd als Substrat (1 % v/v in absolutem Ethanol).
HINWEIS: Das Verhältnis von RLU/koloniebildenden Einheiten (KBE) wurde zuvor auf 3:1 bestimmt, wenn BCG lux in vitro in Middlebrook 7H9-Brühe gezüchtet wurde.
- Die Kultur wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.175 x g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und der Überstand wird in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizider Wirkung abgegeben. Entsorgen Sie alle Kulturabfälle mit Desinfektionsmitteln, die für Mykobakterien gemäß den örtlichen Richtlinien geeignet sind.
- Waschen Sie das Zellpellet zweimal in PBS mit 0,05 % Polysorbat 80 (PBS-T), um Bakterienverklumpungen zu verhindern.
- Nach der letzten Wäsche wird der Überstand des Abfalls dekantiert, das mykobakterielle Zellpellet in PBS-T resuspendiert und die mykobakterielle Suspension mit RLU-Messungen auf die gewünschte Zelldichte verdünnt.
- Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen des Inokulums in 24-Well-Platten mit PBS-T vor. 10 μl auf Middlebrook 7H11-Agarplatten (0,5 % Glycerin, 50 μg/ml Hygromycin, 10 % Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase [OADC]) in doppelter Ausführung auffüllen, um die Anzahl der Inokulum-KBE aufzuzählen.
>2. Vorbereitung von G. mellonella Larven
- Kaufen Sie die Larven der letzten Larven aus geeigneten Quellen und halten Sie die Larven bei der Ankunft im Dunkeln bei 18 °C und verbrauchen Sie sie innerhalb von 1 Woche nach dem Kauf. Alternativ können die Larven nach dem Protokoll von Jojāo et al. selbst aufgezogen werden. Bei gekauften Larven entsorgen Sie tote, verfärbte oder sich verpuppende Larven vor der Lagerung.
HINWEIS: Verpuppende Larven sind morphologisch von den Larven im letzten Stadium unterscheidbar.
- Identifizieren und selektieren Sie gesunde Larven für Experimente, basierend auf einer einheitlichen cremefarbenen Farbe mit wenig bis keiner Verfärbung (Melanisierung), Größe (2-3 cm Länge), Gewicht (ca. 250 mg), einem hohen Maß an Beweglichkeit und der Fähigkeit, sich beim Umdrehen aufzurichten.
- Zählen Sie die gesunden Larven (mindestens 20-30 pro Gruppe) vorsichtig in eine Petrischale (94/15 mm), die mit einer Schicht Filterpapier (94/15 mm) ausgelegt ist, mit einer Pinzette mit stumpfem Ende, um die Kontamination zu minimieren, und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei Raumtemperatur im Dunkeln.
>3. Infektion von G. mellonella mit BCG lux
- Minimieren Sie die Unordnung im MSC, um das Risiko von Kontaminationen und Nadelstichverletzungen zu verringern.
- Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier (94 mm) auf eine flache, erhöhte Oberfläche kleben. Es können weiche oder harte Oberflächen verwendet werden, die ganz von den Vorlieben des Benutzers abhängen, z. B. Pipettenkastendeckel oder ein Nylon-Scheuerschwamm.
- Sterilisieren Sie eine 25-μl-Mikrospritze (25 g), indem Sie 3 Volumen 70%iges Ethanol aspirieren und mit 3 Volumen sterilem PBS-T weiter spülen.
- 10 μl BCG lux-Inokulum (hergestellt in Abschnitt 1) oder PBS-T in die sterilisierte 25-μl-Mikrospritze aspirieren. Verwenden Sie eine separate Spritze für die PBS-T-Negativkontrolle.
HINWEIS: Resuspendieren Sie das BCG lux-Inokulum nach 10 Injektionen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten.
- Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Larve auf und legen Sie sie auf die Injektionsplattform.
- Drehen Sie die Larve auf der Plattform auf den Rücken und fixieren Sie sie, indem Sie Kopf und Schwanz mit einer Pinzette sichern. Lokalisieren Sie den letzten linken Schenkel, der vom Kopf der Larve herunterzählt, und führen Sie die Spitze der Nadel (5−6 mm) vorsichtig in einem Winkel von 10−20° zur horizontalen Ebene ein.
Anmerkung: Kurze und schmale Pinzetten ermöglichen eine einfache Immobilisierung mit minimalem Larvenstress. Achten Sie darauf, nicht zu stark einzudringen, da dies den Darm durchstechen und zu einer nicht-BCG-Lux-spezifischen Melanisierung oder zum Tod führen kann.
- Zählen Sie die infizierten Larven in eine Petrischale, die mit einer Schicht Filterpapier ausgelegt ist, eine einzelne 90-mm-Petrischale kann bis zu 30 Larven aufnehmen.
- Die Petrischale, die die Larven enthält, ist in einer belüfteten oder nicht verschlossenen dunklen Box in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufzubewahren.
>4. Überwachung des Überlebens von G. mellonella nach einer Infektion
- Überwachen Sie im Laufe der Zeit alle 24 Stunden das Überleben der Larven. Larven gelten als tot, wenn sie sich als Reaktion auf Berührung nicht bewegen.
>5. Messung der In-vivo-Belastung durch BCG-Lux in G. mellonella
- Wählen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus, die zuvor in Abschnitt 3 vorbereitet wurden, und sterilisieren Sie die Larvenoberflächen vorsichtig mit Wattestäbchen, die in 70%igem Ethanol getränkt sind.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig bei der Beschichtung von Larvenhomogenat für die mykobakterielle KBE-Enumeration, da nicht sterilisierte Larven zu einer Kontamination führen können.
- Die Larven werden einzeln in 2 ml-Lysingmatrixröhrchen mit 800 μl sterilem PBS gegeben.
- Homogenisieren Sie die Larven mit einem Homogenisator für 60 s bei 6,0 m/s.
- Die Lyseröhrchen werden 5 s lang bei 3.500 x g zentrifugiert, um das Homogenat von den Deckeln zu entfernen, und das Homogenat vorsichtig einzeln in sterile Luminometerröhrchen umgefüllt.
Anmerkung: Für die KBE-Enumeration (Schritt 5.7) ist darauf zu achten, dass 100 μl Homogenat in einem sterilen 1,5-ml-Reaktionsröhrchen aufbewahrt werden.
- Das verbleibende Homogenat wird zurückgewonnen, indem die Lysingmatrixröhrchen mit 1 mL PBS-T gewaschen und in die entsprechenden Luminometerröhrchen pipettiert werden.
- Die Luminometerröhren vortexen und die Biolumineszenz der zuvor in Schritt 1.4 beschriebenen Homogenate messen.
- Bereiten Sie zehnfache serielle Verdünnungen des Homogenats in 24-Well-Kulturplatten mit PBS-T vor. 10 μl der Verdünnung werden auf Middlebrook 7H11-Agarplatten mit 0,5 % Glycerin, 50 μg/ml Hygromycin, 10 % OADC und 20 μg/ml Piperacillin aufgetragen, um das RLU/CFU-Verhältnis von BCG lux nach einer In-vivo-Infektion zu bestimmen.
HINWEIS: Piperacillin eliminiert die native Mikrobiota von G. mellonella mit minimaler Wachstumshemmung von BCG lux.
