Quantifizierung der Helicobacter pylori-Last in einem infizierten Mausmagen

Zusammenfassung

Quelle: D'Costa, K. et al., Mausmodelle für Helicobacter-Infektionen und Magenpathologien. J. Vis. (2018)

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Helicobacter pylori-Belastung im Magengewebe von Mäusen nach der Infektion, um seine Besiedlung zu bestätigen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Bestätigung der bakteriellen Besiedlung im Magen nach einer Infektion

1. Lebensfähige Zählung von H. pylori im Magen
   1. Ergänzen Sie sterile HBA-Platten mit zusätzlichen Antibiotika (200 μg/ml Bacitracin und 10 μg/ml Nalidixinsäure), bevor Sie Koloniezählungen aus infizierten Mausmägen durchführen.
   2. Homogenisieren Sie die Magenabschnitte entweder manuell mit autoklavierbaren Mikrostößeln aus Polypropylen oder mit einem mechanischen Dissoziationsinstrument (siehe Materialtabelle).
   3. Bereiten Sie doppelte serielle Verdünnungen (^10-1 bis ^10-2) der resultierenden Magenhomogenate in sterilem BHI.
      Anmerkung: Die Verdünnungen sollten auf der Grundlage der typischen Bakterienlasten für einen bestimmten H. pylori-Stamm, der für die Infektion verwendet wird, sowie der Dauer der Infektion entschieden werden. Es können auch unverdünnte Proben verwendet werden.
   4. Teilen Sie vorgetrocknete HBA-Platten (HINWEIS: Um die Isolierung einzelner Völker zu gewährleisten, sollten HBA-Platten vor der Verwendung 10–15 Minuten in einer biologischen Sicherheitswerkbank oder einem 37 °C-Inkubator erwärmt und getrocknet werden.) in drei oder vier Segmente aufteilen. Unter Verwendung einer Adaption der Miles- und Misra-Technik werden 10–100 ml jeder Verdünnung auf ein Segment der Agarplatte gegeben und mit sterilen Kunststoffschlaufen verteilt.
   5. Lassen Sie die Platten trocknen und stellen Sie sie dann in einer umgekehrten Position (Deckel mit der Deckelseite nach unten) in anaerobe Gasgläser. Um die Feuchtigkeit in den Gläsern aufrechtzuerhalten, fügen Sie eine Petrischale mit Wasser hinzu.
   6. Die Gläser bei 37 °C inkubieren, bis sich Kolonien bilden (in der Regel 4–7 Tage).
   7. Segment(e) aufzählen, die zwischen 10 und 100 isolierte Kolonien enthalten.
      HINWEIS: H. pylori-Kolonien und H. felis-Wachstum auf Platten können mit Hilfe von Standard-Urease-, Katalase- und Oxidase-Tests von denen anderer Mitglieder der murinen Magenmikrobiota unterschieden werden. H. pylori und H. felis sind bei allen drei Tests positiv.
   8. Berechnen Sie die bakterielle Belastung als (KBE/g Gewebe) mit der folgenden Formel:
      [(Durchschnittliche Anzahl der gezählten Kolonien) × (Verdünnungsfaktor) x (volumenplattiert)]/(Magengewicht).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bakteriologische Reagenzien
Oxoid-Blut-Agar-Basis Nr.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Vor der Sterilisation in deeinonisiertem Wasser auflösen
Premium defibriertes Pferdeblut	Australische ethische Biologika	PDHB100
Bacto Gehirn Herz Infusionsbrühe	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 237500	Vor der Sterilisation in deeinonisiertem Wasser auflösen
CampyGen Gaspakete	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Antibiotika
vancomycin	Sigma Aldrich	V2002-1G	In entionisiertem Wasser auflösen
Polymyxin B	Sigma Aldrich	Nr. P4932-5MU	In entionisiertem Wasser auflösen
Trimethoprim (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	Nr. T7883	In 100% (absolutem) Ethanol auflösen
Amphotericin	Amresco (Astral Wissenschaftlich)	Nr. E437-100MG	In entionisiertem Wasser auflösen
Bacitracin aus Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	Nr. B0125	In entionisiertem Wasser auflösen
Naladixinsäure	Sigma Aldrich	Nr. N8878	In entionisiertem Wasser auflösen
Ausrüstung und Kunststoffe
Oxoid Anaerobe Gläser	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipetten	Interpath-Dienste	200CS01
Eppendorf 5810R Zentrifuge			Sammeln Sie Bakterienpellets durch Zentrifugation bei 2.200 U/min für 10 Minuten bei 4 °C
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Eppendorf Mikrostößel für 1,2 - 2 mL Röhrchen	Sigma Aldrich	Z317314	Autoklavierbare Stößel aus Polypropylen für die Homogenisierung des Magens
GentleMACs-Dissoziator	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-093-235	Verwenden Sie ein voreingestelltes gentleMACS Programm für das Magengewebe von Mäusen
M Röhren (orangefarbene Kappe)	Miltenyi Biotec	Tel.: 30-093-236
Qubit Fluorometer	Thermo Fischer Scientific	Frage 33216
Sterile Kunststoffschlaufe	LabServ	LBSLP7202