$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Kathetern
- Bereiten Sie für jede Gruppe von Mäusen, die infiziert werden sollen, eine Kanüle mit intravenösem Zugang für Kinder vor. Entfernen Sie mit dem eingebauten Federmechanismus jede Kanüle von ihrer Nadel, wie vom Hersteller angegeben. Entsorgen Sie die Nadeln und bewahren Sie nur die intravenöse Kunststoffkanüle auf.
- Sterilisieren Sie Katheter in einer Laminar-Flow-Haube für einen UV-Zyklus, typischerweise 25 - 30 Min.
Hinweis: Katheter können für mehr als eine Maus verwendet werden, jedoch sollte ein neuer Katheter zwischen Versuchsgruppen, Geschlechtern oder Bakterienstämmen verwendet werden.
>2. Vorbereitung von uropathogenen E. coli auf die Infektion
- Mindestens zwei Tage vor der Infektion mit einer sterilen Impfschlaufe UPEC aus einem gefrorenen Bakterienfond auf eine Agarplatte mit Luria-Bouillon (LB) streichen, die gegebenenfalls Antibiotika enthält. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Die Platten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- In einem sterilen 100-ml-Erlenmeyerkolben werden 10 ml LB, gegebenenfalls mit Antibiotika, mit einer einzigen Kolonie aus der LB-Platte beimpft und über Nacht (ca. 16 - 18 Stunden) bei 37 °C inkubiert.
Hinweis: Stehende Kulturen erlauben die Expression von Typ-1-Pili, die für eine Infektion notwendig sind. Kulturen, die zitternd gezüchtet werden, weisen eine weniger effiziente Pili-Expression und daher inkonsistente Infektionsraten auf.
- Messen Sie die optische Dichte (OD)600 der Übernachtkultur und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml anhand einer vorgegebenen Wachstumskurve. Als Beispiel für den UPEC-Stamm UTI89 entspricht OD600 = 0,35 2 x 108 KBE pro ml, so dass eine Übernachtkultur mit einem OD600 = 2,4 13,7 x 108 KBE pro ml entsprechen würde. Bestimmen Sie empirisch die Beziehung zwischen dem OD600 und lebensfähigen Bakterien mit jedem neuen Stamm, der für die Infektion eingesetzt wird.
- Bestimmen Sie die Menge der benötigten Bakterien, indem Sie die Anzahl der zu infizierenden Tiere berücksichtigen und dass jede Maus etwa 10bis 7 koloniebildende Einheiten (KBE) in 50 μl PBS erhalten sollte. Beziehen Sie in die Berechnung das ~130 μl Totvolumen des Katheters und der Spritzennoppe und 100 μl ein, die zur Bestimmung des Inokulums benötigt werden.
- Schleudern Sie die Bakteriensuspension in einer Tischmikrozentrifuge bei 17.000 x g für 1 min und resuspendieren Sie das resultierende Bakterienpellet bei 2 x 108 KBE pro ml in PBS. Verdünnen Sie nacheinander ein Aliquot dieser Suspension und plattieren Sie es auf LB-Agar, gegebenenfalls mit Antibiotika, um das genaue Inokulum für jede Infektion zu bestimmen.
- Ziehen Sie das bakterielle Inokulum in eine 1-ml-Spritze und befestigen Sie den Katheter am Ende der Spritze. Klopfen Sie auf die Spritze, um Luft zu entfernen, und drücken Sie den Kolben, um den toten Luftraum im Katheter zu füllen, bevor Sie mit der Instillation beginnen.
>3. Vorbereitung von Mäusen
- Anästhesieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin. Zusätzliche Wärme kann bereitgestellt werden.
- Stellen Sie sicher, dass jede Maus vollständig sediert ist, indem Sie das Fußpolster mit mittlerem Druck zusammendrücken. Mäuse sind vollständig sediert, wenn sie nicht reagieren und 3 - 5 Minuten benötigen, um diesen Zustand zu erreichen.
- Legen Sie die Mäuse in Rückenlage und üben Sie mittleren Druck auf den Unterbauch aus, um die Blase vom Urin zu entleeren. Volle Blasen fühlen sich an wie eine Erbse unter der Haut zwischen den Beckenkämmen.
Hinweis: Inhalatives Isofluran wurde zur Katheterisierung weiblicher Mäuse verwendet, es wurde jedoch nicht getestet, ob männliche Mäuse für dieses Verfahren ausreichend mit inhalativem Isofluran betäubt werden.
>4. Transurethrale Instillation männlicher Mäuse
- Platzieren Sie zwei Daumenzangen kranial und kaudal an den äußeren Genitalien der Maus. Ziehen Sie die Vorhaut zurück, um die Eichel vollständig freizulegen. Sobald der Penis nach außen positioniert ist, lassen Sie die Daumenzange los.
- Positionieren Sie die Pinzette neu, um den hervorstehenden Penis senkrecht zum Tier zu stabilisieren, und halten Sie das Organ sanft, aber straff. Visualisieren Sie den Harnröhrengang und führen Sie den Katheter vorsichtig in die kleine Öffnung an der Spitze des Organs ein. Führen Sie den Katheter sanft in den Penis in Richtung des Körpers der Maus und halten Sie dabei eine sanfte Spannung mit der Pinzette aufrecht. Der Katheter benötigt keine Schmierung. Schieben Sie den Katheter nicht in den Penis; Der Katheter sollte sanft in die Harnröhre gleiten, was auf die korrekte Platzierung hinweist.
- Sobald die Nabe des Katheters auf die Spitze des Penis trifft, geben Sie sehr langsam 50 μl des Inokulums ab, während Sie die Position des Penis beibehalten. Die Qualität der Instillation kann zu diesem Zeitpunkt anhand eines vorher festgelegten Instillationsqualitätsfaktors, wie in Abbildung 1 gezeigt, notiert werden.
- Ziehen Sie den Katheter langsam über eine Zählung von 5 zurück, um ein Auslaufen des Inokulums zu verhindern. Setzen Sie die Mäuse in Rückenlage in ihre Käfige. Die Tiere sollten sich 30 - 45 Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums zu erholen beginnen.
