Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Kathetern
- Bereiten Sie für jede Gruppe von Mäusen, die infiziert werden sollen, eine Kanüle mit intravenösem Zugang für Kinder vor. Entfernen Sie mit dem eingebauten Federmechanismus jede Kanüle von ihrer Nadel, wie vom Hersteller angegeben. Entsorgen Sie die Nadeln und bewahren Sie nur die intravenöse Kunststoffkanüle auf.
- Sterilisieren Sie Katheter in einer Laminar-Flow-Haube für einen UV-Zyklus, typischerweise 25 - 30 Min.
Anmerkung: Katheter können für mehr als eine Maus verwendet werden, jedoch sollte ein neuer Katheter zwischen Versuchsgruppen, Geschlechtern oder Bakterienstämmen verwendet werden.
2. Vorbereitung von uropathogenen Escherichia coli auf die Infektion
- Mindestens zwei Tage vor der Infektion mit einer sterilen Impfschlaufe uropathogene Escherichia coli (UPEC) aus einem gefrorenen Bakterienbestand auf eine Agarplatte mit Luria-Bouillon (LB) streichen, die gegebenenfalls Antibiotika enthält. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Die Platten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- In einem sterilen 100-ml-Erlenmeyerkolben werden 10 ml LB, gegebenenfalls mit Antibiotika, mit einer einzigen Kolonie aus der LB-Platte beimpft und über Nacht (ca. 16 - 18 Stunden) bei 37 °C inkubiert.
Anmerkung: Stehende Kulturen ermöglichen die Expression von Typ-1-Pili, die für die Infektion notwendig sind. Kulturen, die zitternd gezüchtet werden, weisen eine weniger effiziente Pili-Expression und daher inkonsistente Infektionsraten auf.
- Messen Sie die optische Dichte (OD)600 der Übernachtkultur und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml anhand einer vorgegebenen Wachstumskurve. Als Beispiel für den UPEC-Stamm UTI89 entspricht OD600 = 0,35 2 x 108 koloniebildender Einheit (KBE) pro ml, so dass eine Übernachtkultur mit einem OD600 = 2,4 13,7 x 108 KBE pro ml entsprechen würde. Bestimmen Sie empirisch die Beziehung zwischen dem OD600 und lebensfähigen Bakterien mit jedem neuen Stamm, der für die Infektion eingesetzt wird.
- Bestimmen Sie die Anzahl der benötigten Bakterien, indem Sie die Anzahl der zu infizierenden Tiere berücksichtigen und dass jede Maus etwa 10bis 7 koloniebildende Einheiten (KBE) in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erhalten sollte. Beziehen Sie in die Berechnung das ~130 μl Totvolumen des Katheters und der Spritzennoppe und 100 μl ein, die zur Bestimmung des Inokulums benötigt werden.
- Schleudern Sie die Bakteriensuspension in einer Tischmikrozentrifuge bei 17.000 x g für 1 min und resuspendieren Sie das resultierende Bakterienpellet bei 2 x 108 KBE pro ml in PBS. Verdünnen Sie nacheinander ein Aliquot dieser Suspension und plattieren Sie es auf LB-Agar, gegebenenfalls mit Antibiotika, um das genaue Inokulum für jede Infektion zu bestimmen.
- Ziehen Sie das bakterielle Inokulum in eine 1-ml-Spritze und befestigen Sie den Katheter am Ende der Spritze. Klopfen Sie auf die Spritze, um Luft zu entfernen, und drücken Sie den Kolben, um den toten Luftraum im Katheter zu füllen, bevor Sie mit der Instillation beginnen.
>3. Vorbereitung von Mäusen
- Anästhesieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin. Zusätzliche Wärme kann bereitgestellt werden.
- Stellen Sie sicher, dass jede Maus vollständig sediert ist, indem Sie das Fußpolster mit mittlerem Druck zusammendrücken. Mäuse sind vollständig sediert, wenn sie nicht reagieren und 3 - 5 Minuten benötigen, um diesen Zustand zu erreichen.
- Legen Sie die Mäuse in Rückenlage und üben Sie mittleren Druck auf den Unterbauch aus, um die Blase vom Urin zu entleeren. Volle Blasen fühlen sich an wie eine Erbse unter der Haut zwischen den Beckenkämmen.
Anmerkung: Inhalatives Isofluran wurde zur Katheterisierung weiblicher Mäuse verwendet, es wurde jedoch nicht getestet, ob männliche Mäuse für dieses Verfahren ausreichend mit inhalativem Isofluran betäubt werden.
>4. Transurethrale Instillation weiblicher Mäuse
- Legen Sie mit der nicht dominanten Hand den Daumen auf den Schwanz und einen Finger derselben Hand auf den Bauch der Maus und üben Sie sanften Druck in entgegengesetzte Richtungen aus, um die Maus fest an Ort und Stelle zu halten.
- Platzieren Sie die Spitze des Katheters senkrecht zur Maus an der Harnröhrenöffnung. Schieben Sie den Katheter mit leichtem Druck in die Harnröhre, bis die Nabe auf die Harnröhrenöffnung trifft, und senken Sie gleichzeitig die Spritze so ab, dass sie parallel zur Arbeitsfläche ist. Der Katheter benötigt keine Schmierung. Schieben Sie den Katheter nicht in die Harnröhre und drücken Sie ihn nicht mit Gewalt in die Harnröhre. Der Katheter sollte sanft und leicht in die Harnröhre gleiten, mit wenig bis gar keinem Widerstand.
- Vor dem Einträufeln des Inokulums (Schritt 4.3) ziehen Sie, sobald der Katheter angelegt ist, die Bauchhaut mit dem Finger der nicht dominanten Hand, die sich bereits auf dem Bauch der Maus befindet, sehr vorsichtig in Richtung des Mauskopfes (Schritt 4.1). Wenn sich der Katheter in der Harnröhre befindet, bewegt sich das Gewebe, aus dem die Harnröhrenöffnung besteht, nicht, während sich das Gewebe nach oben und weg vom Katheter bewegt, wenn der Katheter falsch in der Vagina platziert wird. Dieser Schnelltest sollte an jeder Maus durchgeführt werden.
- Wenn die Nabe des Katheters auf die Harnröhrenöffnung trifft, geben Sie langsam 50 μl des bakteriellen Inokulums ab. Eine langsame Instillationsrate minimiert den vesikoureteralen Reflux in die Niere. Entfernen Sie den Katheter langsam, um ein Auslaufen zu verhindern, über eine Zählung von 5. Setzen Sie die Mäuse in Rückenlage in ihre Käfige.
