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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Durchflusszytometrische Analyse von Blasengewebe
- Bereiten Sie einen Aufschlusspuffer vor, der Kollagenase mit 34 Einheiten/ml und DNase mit 100 μg/ml in PBS enthält. Bleiben Sie auf Eis. Bereiten Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen pro zu analysierendem Tier vor und aliquotieren Sie 1 ml Aufschlusspuffer pro Röhrchen.
- Töten Sie Mäuse zu festgelegten Zeitpunkten mit anerkannten Standardarbeitsanweisungen (z. B. Gebärmutterhalsluxation oder Kohlendioxid-Überdosierung). Befeuchten Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol, um die Kontamination durch Fell zu minimieren.
- Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt von mindestens 2 cm quer durch das untere Drittel des Bauches der Maus und entfernen Sie die gesamte Blase. Mit einer Schere gut hacken und die Blase in 2 - 3 mm2 große Stücke schneiden, typischerweise etwa 8 Stücke.
- Geben Sie eine gehackte Blase pro Röhrchen mit Verdauungspuffer hinzu. Schütteln, um das gehackte Blasengewebe in den Verdauungspuffer zu waschen. Auf Eis halten, bis alle Blasen präpariert und zerkleinert sind.
- Inkubieren Sie die gehackte Blase für 60 - 75 min bei 37 °C, wobei Sie alle 15 min 5 s lang kräftig mit der Hand schütteln. Wenn das Gewebe ein glasiges, transparentes Aussehen hat, das an nasses Seidenpapier erinnert, ist die Verdauung abgeschlossen. Eine längere Verdauung entfernt Oberflächenproteine aus den Zellen, die für die Identifizierung benötigt werden, und sollte vermieden werden.
- Inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme durch Zugabe von 2 - 3 mL eiskaltem Durchflusszytometrie-Puffer (PBS enthält 2% fötales Rinderserum (FBS) und 0,2 mM EDTA) und mischen Sie vorsichtig. Röhrchen auf Eis legen.
- Um eine einzellige Suspension zu gewährleisten und jegliches Bindegewebe zu entfernen, leiten Sie den Inhalt des Röhrchens durch einen 100-μm-Filter, der in einem konischen 15-ml-Röhrchen platziert ist. Drücken Sie das restliche Gewebe vorsichtig mit dem Ende eines Spritzenkolbens durch den Filter. Waschen Sie den Filter mit einem zusätzlichen 2 mL Durchflusszytometrie-Puffer. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
- Die Proben werden 7 Minuten lang bei 200 x g, 4 °C zentrifugiert. Die Pellets werden in einem 100 μl Durchflusszytometriepuffer mit Fc-Block, verdünnt auf 5 μg/ml, resuspendiert und auf eine runde 96-Well-Bodenplatte umgefüllt. Nach 10 - 15 Minuten geben Sie 100 μl den gewünschten Antikörpercocktail in jede Probe. Inkubieren Sie die Proben für 30 - 45 min, auf Eis, vor Licht geschützt.
Anmerkung: Der Fc-Block ist ein Reagenz, das verwendet wird, um die Bindung des Fc-Teils von Antikörpern an Zellen zu verhindern, die Fc-Rezeptoren exprimieren. Sein Zweck ist es, die unspezifische Antikörperbindung zu minimieren. Die Bestimmung der zu verwendenden Antikörper hängt von der Hypothese ab, die im Experiment getestet wird, und sollte unter Berücksichtigung der Literatur ausgewählt werden. In Abbildung 1 wurde zur Messung der gesamten Immunzellinfiltration ein Anti-CD45-Antikörper verwendet, bei dem es sich um ein pan-immunes Zellprotein handelt.
- Die Proben werden 7 Minuten lang bei 200 x g, 4 °C durch Zentrifugation gewaschen. Die Zellpellets werden in einem 200 μl Durchflusszytometrie-Puffer resuspendiert und die Proben durch ein 40 μm Zellsieb auf einem 5 ml Polystyrolröhrchen geleitet, kurz bevor sie auf einem Durchflusszytometer entnommen werden.
- Entnehmen Sie die gesamte Probe auf dem Durchflusszytometer. Eine gute Verdauung ergibt 200.000 - 400.000 Zellen, wobei 8.000 - 10.000 CD45+ Immunzellen aus naiven Mausblasen stammen, während infizierte Organe mehr Zellen enthalten (Abbildung 1).
Anmerkung: Proben, die für die durchflusszytometrische Analyse vorbereitet wurden, können nicht zur Bewertung von KBE verwendet werden. Es wird nicht empfohlen, die Blase in zwei Teile zu teilen, da es keine Beweise dafür gibt, dass die Besiedlung durch uropathogene E. coli (UPEC) oder Immunzellen im gesamten Gewebe gleichmäßig ist.
