Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in einer ex vivo Organkultur

Zusammenfassung

Quelle: Rizzuto, G. A., et al. Menschliche Plazenta- und Dezidualorgankulturen zur Untersuchung von Infektionen an der mütterlich-fetalen Grenzfläche. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Infektionsmodells in Plazentagewebe, um die Ausbreitung von Infektionen zu untersuchen. Eine ex vivo Plazenta-Organkultur wird mit Listeria monocytogenes, einem fakultativen intrazellulären Parasiten, infiziert. Die Bakterien dringen in extravillöse Trophoblasten (EVTs) ein, um in das Plazentagewebe einzudringen und sich dann über Zell-zu-Zell-Ausbreitung auf andere Zellen zu vermehren.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung von Organkulturplatten

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden. Es ist ideal, wenn das Präpariermikroskop in einem sterilen Bereich aufgestellt werden kann. Dies ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, solange die Mikrodissektion zügig durchgeführt wird und die Instrumente häufig in 70%iges Ethanol getaucht werden.

1. Fläschchen mit extrazellulärer Matrix (ECM) auf Eis auftauen. Verdünnen Sie das ECM 1:1 mit eiskaltem Auffangmedium und mischen Sie es durch Pipettieren. Pipettieren Sie langsam, um Blasenbildung zu vermeiden. Jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte benötigt 100 μl dieser Suspension und bietet Platz für 3-4 Organkulturen.
2. Setzen Sie Transwell-Einsätze (Porengröße 0,4 μM) in jede Vertiefung der 6-Well-Gewebekulturplatte ein.
3. Jede Transwell-Einlage wird mit einer dünnen Schicht (100 μl) der ECM/Mediensuspension bestreut.
4. Legen Sie die Platte auf Eis und fahren Sie sofort mit der Etablierung von Organkulturen fort. Alternativ können Sie die Platte vor der Gewebeentnahme vorbereiten, in diesem Fall in Parafolie einwickeln und für die spätere Verwendung bei 4 °C lagern. Eine Lagerung von mehr als 6 Stunden wird nicht empfohlen, da das ECM sonst austrocknet.

>2. Etablierung von Organkulturen

HINWEIS: Dieser Schritt beschreibt, wie Dezidualorgankulturen und Zottenorgankulturen in getrennten Transwells platziert werden. Die Gewebe kommen nicht in Kontakt. Forscher, die sich für eine Co-Kultur-Technik interessieren, bei der Decidua und Zotten in direktem Kontakt miteinander stehen, können sich auf die bisherige Literatur beziehen.

Spülen Sie
1. die Proben zweimal in Sammelmedium und zentrifugieren Sie zwischen jedem Spülgang bei 1.000 x g. Übertragen Sie das Gewebe in eine sterile Petrischale und legen Sie es auf den Tisch eines Präpariermikroskops. Bewahren Sie eine 6-Well-Platte auf Eis neben dem Mikroskop auf.
2. Mikrodissektion von Gewebe mit einer sterilen Springer-Präparierschere und -Pinzette, um 2-3 mm zottenlose Organkulturen zu etablieren (Abbildung 1A).
   Anmerkung: Zottenorgankulturen sind kleine, gut vaskularisierte "Bäume" mit 2 oder 3 Ästen und mit prominenten extravillösen Trophoblasten (EVT)-Zellsäulen. Es ist wichtig, nur zottenartiges Gewebe aus Proben aus der <9. Woche des ersten Trimesters zu verwenden, da die Invasion extravillöser Trophoblasten in die EZM in diesem jungen Alter am ausgeprägtesten ist.
3. Selektieren Sie gut vaskularisierte Zotten mit markanten EVT-Zellsäulen. EVT-Zellspalten werden als bauchige, "unscharfe" und "flauschige" Enden dargestellt (siehe Pfeilspitzen in Abbildung 1A).
4. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um 3 oder 4 Zottenbäume in jeden Transwell zu überführen. Passen Sie die Äste so an, dass der Baum flach auf dem ECM positioniert ist, und trennen Sie die verklumpten Äste.
5. Mikrodissektion von Dezidualgewebe mit einer sterilen Springer-Präparierschere und -Pinzette, um 3 mm 3 Dezidualorgankulturen zu etablieren (Abbildung 1A).
   Anmerkung: Die Proben enthalten zwei unterschiedliche Arten von Dezidualgeweben, Decidua parietalis und Decidua capsularis (linke bzw. rechte Gewebefragmente, Abbildung 1A).
6. Mit einer Schere 3 mm 3 Stück Decidua parietalis zuschneiden. Decidua capsularis wird für diese Kulturen nicht verwendet. Benutze eine Pinzette, um geronnenes mütterliches Blut herauszukitzeln.
7. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um 3-4 Stück Laubholz in jeden Transwell zu übertragen.
8. Geben Sie 1 ml Auffangmedium auf den Boden der Vertiefung. Die Platte über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
9. Bei Experimenten, bei denen es wichtig ist, die normale Plazenta-Sauerstoffspannung im ersten Trimester nachzuahmen, halten Sie die Zottenorgankulturen bei relativer Hypoxie (3% O₂).
   Anmerkung: Zu den Laboroptionen gehören kleine Hypoxie-Inkubatorkammern, die in bestehende Inkubatoren passen, oder ein Tri-Gas-Inkubator, der externes N₂ -Gas einführt, um die Sauerstoffkonzentration zu senken.
10. Geben Sie 1 ml Villous- oder Dezidualmedium (Tabelle 1) nach 12-16 Stunden Kultur auf die Oberseite des Transwells.
    Anmerkung: Das Fehlen von Medien während der ersten Nacht in Kultur ermöglicht das Eindringen der extravillösen Trophoblasten-Zellsäulen (Zottenkultur) und das Gewebe (sowohl zottenartig als auch dezidual) kann sicher in die EZM eingebettet werden. Nach unserer Erfahrung bleiben deziduale Organkulturen 72 Stunden und zottenartige Organkulturen 96 Stunden lebensfähig. Wir empfehlen experimentelle Endpunkte, die innerhalb dieses Zeitrahmens liegen. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung von Zotten- und Dezidualmedium. Das Zottenmedium hat einen hohen Anteil an FBS, während das Dezidualmedium mit Schwangerschaftshormonen (Progesteron, 17β-Östradiol) ergänzt wird, die den dezidualisierten Zustand aufrechterhalten (Tabelle 1).

>3. Vorbereitung von L. monocytogenes-Kulturen

HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll über die Langzeitlagerung von L. monocytogenes und die Kultur und das Wachstum dieses Organismus in Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) und Agar verweisen wir bitte auf Wang et al.

1. Nehmen Sie eine einzelne L. monocytogenes-Kolonie aus einer gestreiften BHI-Agarplatte und inokulieren Sie 3 ml BHI-Brühe.
2. Die Kultur von L. monocytogenes über Nacht (16 Stunden) in schräger Position bei 30 °C inkubieren.
   Anmerkung: Diese Kulturbedingungen ermöglichen es, dass das Bakterienwachstum die stationäre Phase erreicht. L. monocytogenes wird bei 30 °C gegeißelt, was die Invasion der Wirtszellen erhöht.

4. Infektion von Organkulturen mit L. monocytogenes

1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Zottiges oder Deziduales Medium (Tabelle 1) auf 37 °C erwärmen.
2. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um alle Organkulturstücke zu entfernen, die nicht in die EZM eingedrungen sind und daher in der Vertiefung schwimmen.
3. Saugen Sie das Medium vorsichtig vom Boden des Transwells an. Spülen Sie die oberen und unteren Transwells zweimal, indem Sie vorsichtig 1 ml warmes PBS in die Vertiefung pipettieren und dazwischen vorsichtig aspirieren. Pipettieren Sie vorsichtig 1 ml antibiotikafreies Villous- oder Dezidualmedium in den oberen und unteren Transwell. Achten Sie darauf, die Organkultur nicht zu stören.
4. Lassen Sie das Gewebe mindestens eine Stunde lang in antibiotikafreien Medien inkubieren, um sicherzustellen, dass die Antibiotika entfernt wurden.
   Anmerkung: In der stationären Phase beträgt die Dichte der L. monocytogenes-Kultur etwa 1 x 10⁹ koloniebildende Einheiten (KBE) pro ml. Die Anzahl der Bakterien, die zur Infektion von Organkulturen verwendet werden, sollte empirisch bestimmt werden, um den experimentellen Bedarf zu decken.
5. Für Wildtyp-L. monocytogenes zeigen routinemäßige Infektionsexperimente eine robuste Invasion mit einer Verdünnung von 1:50 über Nacht (4 x 10,⁷ L. monocytogenes in 1 ml Medium pro Well). Resuspendieren Sie die entsprechende Anzahl von Bakterien in einem antibiotikafreien Villous- oder Dezidualmedium.
6. Saugen Sie das Medium von der Oberseite der Transwells an. Vorsichtig 1 ml Inokulum hinzufügen. Die Platten werden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, um eine bakterielle Invasion zu ermöglichen.
7. Entfernen Sie extrazelluläre Bakterien durch Absaugen von Medien aus den oberen und unteren Transwells. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit warmem PBS aus. 1 ml Villous- oder Dezidualmedium zugeben, ergänzt mit 50 μg ^ml-1 Gentamicin. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in 5 % CO₂,
   HINWEIS: L. monocytogenes ist ein fakultatives intrazelluläres Bakterium, das in einem extrazellulären Medium wachsen, innerhalb von Zellen wachsen und sich von Zelle zu Zelle ausbreiten kann, ohne auf den extrazellulären Raum zuzugreifen. Gentamicin hat eine bakterizide Wirkung auf extrazelluläre L. monocytogenes und ermöglicht somit die Messung des intrazellulären Wachstums und der Ausbreitung von L. monocytogenes in der Organkultur.
   Anmerkung: Die reproduzierbare Infektion von Zotten- und Dezidua-Organkulturen erfolgt mit einer Inkubationszeit von 5 Stunden. Die Inkubationszeit vor der Zugabe von Gentamicin kann je nach experimentellem Bedarf und der Fähigkeit des Organismus, in das Gewebe einzudringen, geändert werden. Um die anatomischsten Stellen besser zu verstehen, die am anfälligsten für Infektionen sind, können kürzere Inkubationszeiten verwendet werden.
8. Die Platten sind für die Dauer des Versuchs auf 37 °C mit 5 % CO₂ zu halten. Wechseln Sie täglich das gesamte Medium in jeder Vertiefung.
   Anmerkung: Nach unserer Erfahrung bleiben L. monocytogenes-infizierte deziduale Organkulturen 48 h und zottenartige Organkulturen 72 h lebensfähig.

Tabelle 1: Medienrezepte. Komponenten und Konzentrationen für die Herstellung von Waschpuffer, Sammelmedium, Zottenmedium und Dezidualmedium

Puffer waschen	Medium der Sammlung	Zottig mittel	Deziduales Medium
Pbs	DMEM/F-12 mit GlutaMAX	DMEM/F-12 mit GlutaMAX	DMEM/F-12 mit GlutaMAX
Penicillin 100 I.E./ml	Fötales Rinderserum 2,5%	Fötales Rinderserum 20%	Fötales Rinderserum 2,5%
Streptomycin 100 μg/ml	Penicillin 100 I.E./ml	Penicillin 100 I.E./ml	17β-Östradiol 300 pg/ml
Gentamicin 50 μg/ml	Streptomycin 100 μg/ml	Streptomycin 100 μg/ml	Progesteron 20 ng/ml
Amphotericin B 1,25 μg/ml	Gentamicin 50 μg/ml
	Amphotericin B 1,25 μg/ml

Ergebnisse

Abbildung 1: Zotten-Organkulturen – Repräsentative grob- und mikroskopische Aufnahmen.

(A) Zwei terminale Zottenbäume mit einem Gestationsalter von 6 Wochen, betrachtet unter einem Präpariermikroskop. Beachten Sie die "flauschigen" Enden (Pfeilspitzen) und das markante fötale Gefäßsystem, das durch die Äste des Baumes auf der linken Sei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterilisations-Beutel	Fisher Scientific	Tel.: 01-812-54	Zum Autoklavieren einzelner Präparierwerkzeuge
Feinmaschiges Sieb	Cuisinart (Amazon.com)	Na	Vor der Gewebeentnahme vollständig in Alufolie einwickeln und autoklavieren.
Ballonflasche mit Zapfhahn	Fisher Scientific	Tel.: 03-007-647	Für die großvolumige Vorbereitung von Waschpuffer.
Eisbeutel	Nortech-Labore	GB8818	Diese müssen nicht gekauft werden, sondern können aus jedem routinemäßigen Laborversand, der sie in der Verpackung enthält, recycelt/wiederverwendet werden.
70% Ethanol	VWR	Nr. V1001	70%ige Lösung, die durch Zugabe von dH20 zu 190- oder 200-prozentigem Forschungsalkohol hergestellt wird.
10% Bleiche	Waxie Sanitärversorgung	CLO 30966	10%ige Lösung, die durch Zugabe von dH20 hergestellt wird.
Leuchtkasten	Litebox Lumina (dickblick.com)	Nr. 55305-2009	Beachten Sie, dass Ersatzlampen auch bei Blick gekauft wurden (55305.0100)
Mikro-Präparierzange	Stoelting	Artikel-Nr.: 52102-43	4 Zoll, 1x2 0,5 mm, leichte Krümmung
Mikro-Präparierzange	Stoelting	Artikel-Nr.: 52102-06	4in, gerade fein, scharf
Mikro-Präparier-Federschere vannas	Stoelting	52130-01P	McPherson-Vannas Federschere, 8,5cm, 0,33 Spitze, leichte Wölbung
Präpariermikroskop	Leica Mikrosysteme	MZ16 oder M60	Wir hatten Erfolg mit den aufgeführten Modellen. Externe flexible Schwanenhals-Lichtquellen sind hilfreich, aber nicht notwendig.
Konische 50 mL Röhrchen	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Wir kaufen von unserer universitären Tissue Culture Core-Einrichtung, alternative Optionen wie diese stehen zur Verfügung.
10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Teknova	Nr. P0195	Für die Vorbereitung des Waschpuffers verwenden wir 10X PBS
DMEM/F-12 Nährstoffmischung (Schinken) mit GlutaMAX	Gibco (Lebenstechnologien)	Artikel-Nr.: 10565-018	Wir kaufen diese spezielle Medienformulierung, die 2,438 g/l Natriumbicarbonat, 55 mg/l Natriumpyruvat und 4,5 g/l Glukose enthält
gentamicin	Thermofisher Scientific	15710072	1000X Lagerbestand. Es wird empfohlen, Aliquots vorzubereiten und bei -20 °C zu lagern, um ein Einfrieren/Auftauen zu vermeiden.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Nr. 15140-122	100X Lagerbestand. Es wird empfohlen, Aliquots vorzubereiten und bei -20 °C zu lagern, um ein Einfrieren/Auftauen zu vermeiden.
Amphotericin B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Artikel-Nr.: 15290-018	500X Lagerbestand. Es wird empfohlen, Aliquots vorzubereiten und bei -20 °C zu lagern, um ein Einfrieren/Auftauen zu vermeiden.
Progesteron	Sigma-Aldrich	Nr. P8783	Eine 1 mM Stammlösung wird hergestellt, indem 15,7 mg Progesteronpulver in 15,7 ml Ethanol rekonstituiert und 34,3 ml PBS hinzugefügt werden. Die Lösung wird steril filtriert, aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
17β-Östradiol	Sigma-Aldrich	Nr. E2758	Eine 10 μM Stammlösung wird durch Rekonstitution von 13,5 mg Östradiolpulver in 10 ml Ethanol und Zugabe von 40 ml PBS hergestellt. Die Lösung wird steril filtriert, aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Vakuumfilter mit Flaschenaufsatz (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Zur Sterilfiltration von Sammelmedien nach der Aufbereitung
6-Well-Gewebekulturplatte	BD Falke	353224	Polystyrol, Gewebekultur behandelt
6-Brunnen-Transwells	Millipore	PICM03050	Einsatz - hydrophile PTFE-Membran mit 30 mm Durchmesser, 0,4 μm Porengröße
Extrazelluläre Matrix (z. B. Matrigel-Matrix)	BD Biowissenschaften	354234	Wir haben Matrigel Matrix in unseren Studien verwendet. Bei Raumtemperatur und -20 °C ist es ein Feststoff. Wiederholtes Einfrieren/Auftauen vermeiden. Tauen Sie die Flasche auf eine viskose Lösung bei 4 °C auf und bereiten Sie ~300 μl Aliquots im Kühlraum mit gekühlten Pipettenspitzen vor. Aliquote bei -20 °C lagern.
Paraformaldehyd, 16 % w/v wässrige Lösung	Alfa Aesar	Artikel-Nr.: 30525-89-4	Für die Gewebefixierung wird ein frisches Präparat aus 4% Paraformaldehyd hergestellt, indem dieser Stoff in PBS verdünnt wird.
Gewebekultur-Inkubator, gehalten bei 37 °C, 5 % CO2, 3 % Sauerstoff (optional für zottenartige Organkulturen)			Für einige Experimente kann Hypoxie bevorzugt werden. Dies kann auf verschiedene Weise festgestellt werden, einschließlich der Zugabe von exogenem Stickstoff über eine Gasflasche, Tygon-Schläuche und einen Regler.
Tischzentrifuge