Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
VORSICHT: Die Arbeit mit menschlichen Blutproben und menschlichen Malariaparasiten erfordert Vorsichtsmaßnahmen. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2. Im Falle einer versehentlichen perkutanen Exposition gegenüber menschlicher Malaria ist bei Health and Safety eine prophylaktische Behandlung zu beantragen. Für die Arbeit mit dem humanen Immundefizienzvirus HIV(+)-Blut sollten auch zusätzliche Sicherheitsüberlegungen angestellt werden. Tragen Sie einen Laborkittel, der den Rücken schließt. Doppelhandschuh (der obere Handschuh sollte aus Latex sein). Führen Sie alle Handhabungen in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2 durch. Verwenden Sie kein Glas oder scharfe Gegenstände. Verwenden Sie keinen Aspirator. Legen Sie alle kontaminierten Gegenstände mindestens 1 Stunde lang in Virox-Lösung oder Bleichmittel, bevor Sie sie entsorgen. Waschen Sie alle Oberflächen nach Gebrauch 1 Stunde lang mit Virox und Ultraviolett (UV). Beachten Sie, dass jede Institution ihre eigenen spezifischen Biosicherheitsvorschriften hat, die befolgt werden müssen. Melden Sie alle versehentlichen Expositionen mit HIV-infiziertem Blut an Health and Safety zur Bewertung und Prüfung einer möglichen Postexpositionsprophylaxe.
Hinweis: Es gibt verschiedene Stämme von P. falciparum Malaria-Parasiten. Für diese Experimente wurde ITG verwendet, es können aber auch unterschiedliche Stämme verwendet werden. Ausgezeichnete Anleitungen zum Einfrieren und Auftauen von Plasmodium falciparum Parasiten sind auf der MR4-Website verfügbar.
1. Herstellung von RPMI-A für die Malaria-Parasitenkultur
- RPMI-0 wird durch Mischen von 950 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O), 1 Päckchen Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 Pulver, 6 g N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-Ethansulfonsäure (HEPES), 2 g Natriumbicarbonat und 1,35 mg Hypoxanthin gemischt.
- Tauen Sie hitzeinaktiviertes Humanserum von zwei verschiedenen Spendern auf. AB-Spender sind am besten, aber jeder kann verwendet werden, wenn Parasiten in roten Blutkörperchen (RBC) vom O-Typ gezüchtet werden. Drehen Sie die Röhren zum Mischen um. Wenn das Serum Feinstaub enthält oder dickflüssig ist, schleudern Sie bei 2.000 U/min und filtern Sie dann den flüssigen Teil mit einer 0,45-μm-Filtereinheit.
- Filtrieren Sie mit einer 0,2-μm-Filtereinheit 180 ml RPMI-0, 20 ml Humanserum (10 ml von jedem Spender) und 0,5 ml 10 mg/ml Gentamycin.
Hinweis: Humanserum kann den Filter verstopfen, daher kann mehr als eine Filtereinheit erforderlich sein.
- Beschriften Sie die mittlere Flasche mit RPMI-A, dem Datum und der Quelle des Serums. Bis zur Verwendung in den Kühlschrank stellen. RPMI-A kann im Kühlschrank trüb werden. Das ist normal, aber eine zunehmende Bewölkung ist ein Zeichen für eine Kontamination.
Hinweis: Das Parasitenwachstum kann bei verschiedenen Spenderseren variieren. Es ist eine gute Idee, alle Serumchargen vor der Verwendung auf gutes Parasitenwachstum zu testen.
2. Vorbereitung menschlicher roter Blutkörperchen für die Parasitenkultur
Hinweis: Blutspender sollten vom Typ O sein.
- Sammeln Sie 7-10 ml Blut in Säure-Citrat-Dextrose-Röhrchen (ACD). Schreiben Sie die ID des Spenders und das Datum der Entnahme auf das Etikett.
- Blut bis zur Verwendung bei 4 oC lagern. Verwenden Sie Blut für Parasitenkulturen innerhalb von 1 Monat.
- Wischen Sie die Oberseite der Tube mit 70% Ethanol ab. Entfernen Sie vorsichtig den Stopfen und entsorgen Sie ihn. Übertragen Sie das Blut in ein 15-ml-Röhrchen. 3 Minuten lang bei 1.000 x g drehen. Entfernen Sie das Plasma durch Aspiration.
- Suspendieren Sie RBC mit dem gleichen Volumen von warmem RPMI-0. 5 Minuten lang bei 1.000 x g drehen. Entfernen Sie das Buffy Coat durch Aspiration, resuspendieren Sie es in 5 ml RPMI-0 und wiederholen Sie die Wäsche noch 2 Mal.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie so viel RPMI-A hinzu, dass ein Gemisch mit 50 Vol.-% RBC entsteht.
- Bis zur Verwendung bei 4 oC lagern.
3. Pflege von Parasitenkulturen
- RPMI-A auf 37 oC vorwärmen.
- Aufgetaute Parasiten (siehe MR4-Protokoll für das Auftauverfahren) in einen T25-Kolben mit 5 ml RPMI-A und 75 μl gewaschenen humanen Erythrozyten geben, um einen Hämatokrit von ~3% zu erhalten. Hinweis: Der Hämatokrit misst das Volumen der Erythrozyten im Vergleich zum Gesamtvolumen. Um den Hämatokrit zu berechnen, messen Sie das Volumen der gepackten Erythrozyten im Verhältnis zum Gesamtvolumen des Mediums plus Erythrozyten. Nehmen wir an, dass die aufgetauten Parasiten 75 μl Erythrozyten beisteuern. Durch Zugabe von 150 μl RBC-Stamm (was der Zugabe von 75 μl gepacktem RBC entspricht) in den Kolben erhalten Sie insgesamt 150 μl RBC in 5 ml Medium, was einem Hämatokrit von 3 % entspricht (150 μl/5.000 μl x 100 % = 3 %).
- Der Kolben wird 30 Sekunden lang mit einem Parasitengasgemisch (1 % O2, 3 % CO2, Rest N2) begast. Der Kolben wird verschlossen und mit der breiten Seite nach unten in einen 37 oC Inkubator gestellt, um die größte Oberfläche für den Gasaustausch zu ermöglichen.
- Um das Medium zu wechseln und auf Parasitämie zu prüfen (muss täglich durchgeführt werden), bewegen Sie den Kolben vorsichtig, um die Erythrozytenschicht nicht zu stören. Mit einer sterilen, unplugged Pasteur-Pipette das Nährmedium abziehen, ohne die Blutschicht zu stören.
- Um die Parasitämie zu überprüfen, entnehmen Sie eine 10 μl große Probe aus der Blutschicht, legen Sie sie auf einen Objektträger und erzeugen Sie mit einem zweiten Objektträger einen dünnen Blutfilm. Lassen Sie die Folie trocknen.
- 4 ml frisches RPMI-A in den Kolben geben, vorsichtig mischen, 30 Sek. lang begasen und in einen Inkubator bei 37 °C stellen.
- Färben Sie den Objektträger mit dem Hema3-Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Für eine optimale Färbung tauchen Sie die Objektträger 10 Sekunden lang in die Fixierlösung, 10 Sekunden in Lösung I und 30 Sekunden in Lösung II. Spülen Sie es mit Wasser ab und lassen Sie die Objektträger trocknen.
- Berechnen Sie die Parasitämie, indem Sie die Anzahl von Plasmodium falciparum RBC, PfRBC (dunkelviolett gefärbt) gegen die Gesamtzahl der RBC (rosa gefärbt) zählen. Zählen Sie insgesamt 300 Zellen, um die Genauigkeit zu gewährleisten.
- Wenn die Parasiten eine Parasitämie von 5 % erreicht haben, wird die Kultur mit 40 ml RPMI-A und 500 μl RBC in einen T75-Kolben expandiert.
4. Parasiten-Synchronisation
Hinweis: Synchronisieren Sie die Parasitenkultur am Tag vor dem Experiment, indem Sie sie mit Alanin behandeln. Nur Parasiten im Ringstadium und nicht infizierte Erythrozyten überleben diese Behandlung. Durch die Alanin-Synchronisation erhalten Sie am nächsten Tag eine reine Trophozoitenkultur, die in den Co-Kultur-Experimenten verwendet werden kann. Stellen Sie sicher, dass Sie mit einer Parasitenkultur beginnen, die einen Großteil der Parasiten im Ringstadium enthält.
- Bereiten Sie Alaninlösung vor, indem Sie 8,01 g Alanin (300 mM) und 0,365 g Tris (10 mM) in 300 ml ddH2O mischen. Bringen Sie den pH-Wert auf 7,4. Die Filtersterilisation erfolgt mit einer 0,2 μm Filtereinheit.
- Die Alaninlösung auf 37 oC vorwärmen.
- Schleudern Sie die Parasitenkultur herunter (5 min x 1.000 x g) und entfernen Sie das Medium.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 19 Volumina Alaninlösung (1 ml packte Erythrozyten auf 19 ml Alaninlösung). 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- 5 min x 1.000 x g drehen. Überstand aspirieren. Einmal in RPMI-0 waschen. Überstand aspirieren und in RPMI-A resuspendieren und Hämatokrit auf ~3% einstellen. Gasflasche und Rückkehr zu 37 oC.
Hinweis: Für Co-Kultur-Experimente ist eine Mindestparasitämie von 5 % Trophozoiten erforderlich, wobei 10 % Parasitämie als optimal angesehen wird.
5. Vorbereitung von Parasiten und Erythrozyten für Co-Kulturexperimente
- Verwenden Sie ein Verhältnis von 3 PfRBC pro PBMC in Co-Kulturexperimenten, um eine Entzündungsreaktion zu induzieren. Um die Gesamt-PfRBC zu berechnen, quantifizieren Sie die Parasitämie, indem Sie einen dünnen Blutausstrich machen, wie in 3.5 beschrieben, und den Hämatokrit, indem Sie die Anzahl der Erythrozyten pro ml Parasitenkultur mit einem Hämozytometer zählen.
Anzahl der PfRBC = % Parasitämie x Gesamt-RBC/ml x ml Kultur. Beispiel: 10 ml Kultur bei 10 x 106 RBC/ml und 10 % Parasitämie entsprechen 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
- Schleudern Sie die Parasitenkultur 5 Minuten lang bei 1.000 x g (RT). Medium aspirieren und bei 6 x 106 PfRBC pro ml in RPMI-S+ resuspendieren (500 ml RPMI-1640 ergänzt mit L-Glutamin und HEPES, 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 1,5 ml Gentamicin, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat, 5 ml 10 mM MEM nichtessentielle Aminosäuren, 5 ml 5 mM β-Mercaptoethanol).
- Entnehmen Sie Kontrollblut (nicht infizierte Erythrozyten von demselben Spender, der für die Aufrechterhaltung der Parasitenkultur verwendet wurde), berechnen Sie den Hämatokrit und resuspendieren Sie in RPMI-S+ mit der gleichen Anzahl von Erythrozyten pro ml wie die Parasitenkultur.
6. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)
- Entnehmen Sie venöses Blut in Natrium-Heparin-Röhrchen (grüne Oberseite) sowohl von einem chronischen HIV(+)-Spender als auch von einer HIV(-)-Kontrollperson. Verwenden Sie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) nicht als Antikoagulans, da die kalziumchelbildende Wirkung von EDTA die Zellfunktion beeinflusst. Im Durchschnitt erwarten Sie zwischen 5-10 x 106 PBMC pro 10 ml Blut. Für ein typisches Experiment sammeln Sie 30 ml Blut von jedem Spender. Das Blutvolumen muss entsprechend den experimentellen Anforderungen angepasst werden.
- Entnehmen Sie so schnell wie möglich und auf jeden Fall innerhalb einer Stunde nach der Blutentnahme das Blut aus den Röhrchen und geben Sie es in ein 50-ml-Plastikröhrchen. Vor allem Monozyten werden aktiviert und haften an Glas, daher ist es wichtig, dass bei der Verwendung von Blutentnahmeröhrchen aus Glas so schnell wie möglich Zellen entnommen werden.
- Schleudern Sie das Blut bei 1.000 x g für 15 min und sammeln Sie Plasma (dies kann bei Bedarf für andere Studien verwendet werden – wenn nicht, kann dieser Schritt übersprungen werden). Verdünnen Sie das Blut mit einem gleichen Volumen kalter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
- Geben Sie 15 ml RT Ficoll in ein 50 ml Röhrchen. Schichten Sie die Blut-/DPBS-Lösung langsam mit einer sterilen Transferpipette aus Kunststoff über das Ficoll, ohne es zu mischen. Jeweils 15 ml Ficoll können maximal 25 ml Blut/DPBS-Lösung übereinander geschichtet werden.
- Drehen Sie die Gradienten 30 Minuten lang bei RT bei 600 x g. Vergewissern Sie sich, dass die Einstellung "Keine Bremse" aktiviert ist.
- Sobald sich die Zellen gedreht haben, suchen Sie nach der Grenzfläche zwischen den beiden Phasen. Hier befinden sich die PBMCs. Sammeln Sie die PBMC mit einer sterilen Transferpipette aus Kunststoff von der Grenzfläche (siehe Abbildung 1). Minimieren Sie die Kontamination durch RBC.
- Geben Sie die gesammelten Zellen in 50-ml-Röhrchen, wobei nicht mehr als 20 ml pro Röhrchen verwendet werden dürfen. Oberrohr bis 50 ml mit sterilem Kalt-DPBS.
- Die Zellen 10 Minuten lang bei 4 oC bei 300 x g drehen.
- Überstand verwerfen, Pellet in 5 ml sterilem kaltem DPBS resuspendieren und alle Zellen desselben Spenders in ein Röhrchen poolen. Füllen Sie bis zu 50 ml steriles DPBS auf und wiederholen Sie die Waschschritte noch 2 Mal.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml RPMI-S+ Medium.
- Ein 20 μl Aliquot entnehmen und mit 20 μl Trypanblau mischen. Pipettieren Sie 10 μl in ein Hämozytometer und zählen Sie die lebenden Zellen (Zellen, die den blauen Farbstoff nicht aufgenommen haben – alle blauen Zellen sind tot). Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellzahl in einer Lösung wie folgt zu berechnen.
Hinweis: Ein Hämozytometer hat ein Gitter mit bestimmten Abmessungen, so dass der von den Linien abgedeckte Bereich bekannt ist.
- Stellen Sie sicher, dass das Hämozytometer sauber ist. Legen Sie das Deckglas über den Zählbereich. Laden Sie 10 μl Zelllösung, indem Sie die Pipettenspitze in eine der V-förmigen Vertiefungen einsetzen. Der Bereich unter dem Deckglas wird durch Kapillarwirkung ausgefüllt.
- Stellen Sie das geladene Hämozytometer unter ein Mikroskop. Das vollständige Gitter des Hämozytometers enthält 9 Quadrate zu je 1 mm2. Zählen Sie alle Zellen innerhalb jedes großen Quadrats. Wenn zu viele Zellen vorhanden sind, verdünnen Sie die Lösung weiter und zählen Sie erneut.
- Berechnen Sie die Zellkonzentration wie folgt: Gesamtzahl der Zellen/ml = (Gesamtzahl der gezählten Zellen/# der Quadrate) x Verdünnungsfaktor x 10.000 Zellen/ml, , z. B. (500 Zellen/5 Quadrate) x Verdünnungsfaktor von 20 x 10.000 Zellen/ml = 20 x 106 Zellen insgesamt.
- Stellen Sie das Medium auf eine Endkonzentration von 10 x 106 pro ml (RPMI-S+ Medium) ein.
7. Kultur der Malaria/HIV-Koinfektion
- Platte 100 μl isolierte PBMCs und 400 μl RPMI-S+-Medium auf eine 24-Well-Platte (1 x 106 PBMC pro Well). Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung eingerichtet sind: 3 Vertiefungen für nicht infizierte RBC, 3 Vertiefungen mit PfRBC, 3 Vertiefungen mit Medium und 3 Vertiefungen mit PMA/Ionomycin. Dies gilt sowohl für die HIV(+)- als auch für die HIV(-)-Probe.
- Für die PfRBC-Vertiefungen werden 3 x 106 PfRBC in jede der Vertiefungen gegeben (500 μl der in 5.2 hergestellten Parasitenkultur).
- Bei nicht infizierten Erythrozyten-Vertiefungen werden 500 μl der nicht infizierten Erythrozytenkultur, die in 5.3 vorbereitet wurde, in jede der Vertiefungen gegeben.
- Bei mittleren Vertiefungen geben Sie 500 μl RPMI-S+ Medium in jede der Vertiefungen.
- Für PMA/Ionomycin-Wells ist PMA/Ionomycin-Lösung (2,5 pg/ml bzw. 250 pg/ml) herzustellen. Geben Sie 500 μl dieser Lösung in jede Vertiefung.
Hinweis: Als potente Stimulatoren der T-Zell-Zytokinsekretion werden PMA und Ionomycin als Positivkontrollen verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen funktionsfähig sind.
- Stellen Sie die Platte bei 37 oC in einen Inkubator mit 5 % CO2.
- Optional: Verwenden Sie überschüssige Zellen für die phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder lagern Sie sie in einer RNA-Stabilisierungslösung für zukünftige mRNA-Expressionsanalysen.
8. Nachweis von Immunreaktionen bei Malaria
Hinweis: Führen Sie Co-Kultur-Experimente für eine Dauer von bis zu 4 Tagen durch. In dieser Zeit ist kein Medienwechsel erforderlich. Der optimale Zeitpunkt hängt vom interessierenden Zelltyp und der gestellten Frage ab. Eine Inkubation von 12-48 Stunden ist optimal für monozytäre Reaktionen auf PfRBCs, während Lymphozytenreaktionen am besten nach 72-96 Stunden beobachtet wurden. Die Zeitpunkte müssen auf der Grundlage der experimentellen Fragestellung optimiert werden. Kürzere Zeiträume (2-4 Stunden) können verwendet werden, wenn die Wechselwirkung zwischen intakten PfRBC und PBMCs von Interesse ist.
- Spin Plate bei 300 x g für 3 min zum Pelletieren von Zellen. Aus jeder Vertiefung werden 700 μl Kulturüberstand entnommen.
- Schleudern Sie den Überstand 5 Minuten lang bei 1.000 x g, um Schmutz zu entfernen.
- Aliquot den geklärten Überstand nach Bedarf, markieren und bei unter -20 °C einfrieren, bis eine Analyse der sezernierten Faktoren durchgeführt werden soll.
