$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. GvHD-Induktion
- Tag 0: Ganzkörperbestrahlung der Empfängermäuse
- Als Empfänger werden weibliche CD45.2+ H2kd+ BALB/c-Mäuse verwendet, die mindestens 10 Wochen alt sind.
- Wiegen und notieren Sie das Gewicht der Empfängermäuse vor der GvHD-Induktion.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass der Empfänger ein Mindestkörpergewicht von 20 g hat. Das Ausgangskörpergewicht dient als Referenzwert, um den Gewichtsverlust der einzelnen Maus im Verlauf der GvHD-Induktion und -Progression zu berechnen.
- Legen Sie bis zu fünf Mäuse in den Behälter des Röntgenstrahlers.
- Bestrahlen Sie die Mäuse durch Ganzkörperbestrahlung mit einer Einzeldosis von 8 Gy Röntgenstrahlen. Verwenden Sie Cs137 als Strahlungsquelle.
- Tag 1: Rekonstitution der bestrahlten Mäuse mit T-Zell-depletiertem Knochenmark
Anmerkung: Die Transplantation allogener Knochenmarkzellen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben und detailliert, sollte innerhalb von 24 Stunden nach der Bestrahlung erfolgen. Führen Sie die unten beschriebenen Verfahren in einer sterilen Gewebekulturhaube durch und verwenden Sie gefilterte Reagenzien. Verwenden Sie allogenes CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl Mäuse als Spender für T-Zell-depletes Knochenmark.
- CD45.1/LY5.1 B6 einschläfern. SJL-Mäuse, die allogene Knochenmarkzellen gemäß den institutionellen Richtlinien spenden, 12-24 h nach der Bestrahlung der Empfänger-BALB/c-Mäuse. Betäuben Sie dazu das CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Mäuse durch Inhalation von 5% Isofluran. Fahren Sie mit der Isofluran-Exposition über 1 Minute nach dem Atemstillstand fort und bestätigen Sie die Euthanasie durch Zervixluxation.
- Desinfizieren Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70% Ethanol.
- Positionieren Sie die Maus so auf einer sauberen Arbeitsschleuse, dass sich die Maus in Bauchlage befindet und die Hinterhand zum Experimentator zeigt. Heben Sie das Fell an der Achillesferse mit der Spitze einer Semken-Pinzette mit einer Länge von 13 cm und gezackten, gebogenen Spitzen an. Schneiden Sie die Haut zwischen Pinzette und Ferse mit einer gehärteten 8,5 cm feinen Schere mit geraden Spitzen ein.
- Verlängern Sie den Schnitt kranial (d.h. von der Ferse über den Unterschenkel und Oberschenkel bis in die Hüftregion). Entfernen Sie die Haut und das Fell von der Hintergliedmaße mit Hilfe der Pinzette.
- Führen Sie die gleiche Prozedur an der anderen Hintergliedmaße durch.
- Entfernen Sie die hinteren Gliedmaßen, indem Sie die angrenzenden Hüftgelenke durchschneiden.
- Schneide die Hinterpfoten ab. Schneide durch das Kniegelenk. Lagern Sie den Oberschenkel und den Schaft aller hinteren Gliedmaßen zusammen in einer 92-mm-Petrischale, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis gefüllt ist.
- Reinigen Sie die Oberschenkel- und Tibiaknochen sorgfältig, indem Sie so viel Muskelgewebe wie möglich von jedem Oberschenkel und Schaft entfernen. Übertragen Sie die Femur- und Tibiaknochen in ein 50-ml-Röhrchen, das mit sterilem RPMI 1640-Medium gefüllt ist, und legen Sie es auf Nasseis, bis alle in Schritt 1.2.7 gesammelten Tibia- und Femurknochen vom Muskelgewebe gereinigt sind.
- Um das Knochenmark zu isolieren, wird jeweils ein Femur- oder Tibiaknochen (der wie in Schritt 1.2.8 beschrieben gereinigt wurde) aus dem 50-ml-Röhrchen in eine Petrischale (mit einem Durchmesser von 92 mm) übertragen, die mit dem Medium RPMI 1640 gefüllt ist. Schneiden Sie mit einem Skalpell die Enden des Oberschenkelknochens oder des Schienbeins ab, um Zugang zu der Knochenhöhle zu erhalten, in der sich das Knochenmark befindet.
- Bereiten Sie ein 50-ml-Entnahmeröhrchen mit 5 mL RPMI 1640-Medium vor. Führen Sie eine 26-G-Nadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die mit 1 ml RPMI 1640 Medium gefüllt ist, in die Knochenhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark aus der Kavität in das Sammelröhrchen, indem Sie den Kolben drücken.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.10, bis der Knochen hell und glänzend erscheint (d.h. die Knochenhöhle ist sichtbar frei von rötlichem Knochenmark). Entsorge den leeren Knochen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.9 bis 1.2.11 unter Verwendung aller Femur- und Tibiaknochen aus Schritt 1.2.8 und sammeln Sie alle gewonnenen Knochenmarkstücke in demselben 50-ml-Entnahmeröhrchen aus Schritt 1.2.10. Halten Sie das Entnahmeröhrchen auf nasses Eis, bis alle Knochen aus Schritt 1.2.8 entsprechend bearbeitet wurden.
- Stellen Sie eine einzellige Suspension her, indem Sie die gespülten, krümeligen Knochenmarkstücke sanft auf und ab pipettieren. Filtrieren Sie die Einzelzellsuspension des Knochenmarks durch ein 40-μm-Siebzellensieb, das auf ein neues 50-ml-Entnahmeröhrchen aufgesetzt ist.
- Das 50-ml-Entnahmeröhrchen mit der einzelligen Knochenmarksuspension bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL ACK-Lysingpuffer (1 mM Na2EDTA; 10 mM KHCO3; 144 mM NH4Cl; pH 7,2) für die Lyse der roten Blutkörperchen. Inkubieren Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend sofort 10 ml PBS-Lösung in die Zellsuspension.
- Die Suspension wird bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 2 ml PBS-Lösung resuspendiert.
- Zählen Sie die Knochenmarkzellen mit einem Hämozytometer. Ein Aliquot von 6 x 106 Zellen wird für die Durchflusszytometrie aufbewahrt, um die Reinheit der Zellen nach der Zellreinigung zu überprüfen (siehe Schritt 1.2.20).
- Für die Depletion von T-Zellen aus der Einzelzellsuspension des Knochenmarks verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Zellaufreinigungskit. Depletieren Sie CD90.2+-Zellen (d. h. Lymphozyten) magnetisch aus den gesamten Knochenmarkzellen, gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Die T-Zell-depletierten Knochenmarkzellen, die wie in Schritt 1.2.18 beschrieben isoliert wurden, werden mit einem Hämozytometer gezählt. Ein Aliquot von 1 x 106 Zellen wird für die später durchzuführende Durchflusszytometrie-Analyse aufbewahrt, wie in Schritt 1.2.20.
beschrieben
Anmerkung: Die durchschnittliche Zellausbeute einer Spendermaus liegt in der Regel zwischen 2 x 107 und 3,4 x 107 T-Zell-depletierten Knochenmarkzellen.
- Bestätigung einer erfolgreichen T-Zell-Depletion durch Durchflusszytometrie. Färbemittel 1 x 106 Zellen, konserviert aus den Schritten 1.2.17 (Knochenmarkzellen vor magnetischer Zelltrennung) und 1.2.19 (T-Zell-depletierte Knochenmarkzellen nach magnetischer Zelltrennung), mit folgenden Antikörpern: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) und α-CD8α (53-6.7). Die restlichen Zellen aus Schritt 1.2.17 werden als ungefärbte Kontrolle und für Einzelfärbekontrollen verwendet, um das Durchflusszytometer einzurichten.
- Übertragen Sie 1 x 106 Zellen aus jeder Probe in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit V-Boden, um das durchflusszytometrische Färbeverfahren durchzuführen.
- Die Zellen werden in der 96-Well-Platte (Schritt 1.2.20.1) bei 450 x g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 100 μl FACS-Puffer (PBS ergänzt mit 3 % gefiltertem Rinderserum) resuspendiert.
- Die Zellen werden in der 96-Well-Platte bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
- Eine geeignete Menge des Antikörpers der Wahl (vgl. Schritt 1.2.20) wird den Proben für die Einzelfärbung in 100 μl FACS-Puffer zugesetzt.
- Es wird eine Mischung aller Antikörper (Mastermix) hergestellt, die die entsprechenden Mengen enthält, die ausreichen, um die Aliquot der Knochenmarkzellen, die vor (siehe Schritt 1.2.17) und nach (siehe Schritt 1.2.19) erhalten geblieben sind, getrennt zu färben. Geben Sie 100 μl des Mastermixes zu beiden Aliquoten.
- Geben Sie nur 100 μl FACS-Puffer in die ungefärbte Probe.
- Inkubieren Sie die Zellen in der 96-Well-Platte für 20 Minuten bei 4 °C im Dunkeln.
- Fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen in der 96-Well-Platte bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl FACS-Puffer
.
- Die Zellen werden bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden in 250 μl FACS-Puffer resuspendiert.
- Übertragen Sie die Proben in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer, das in der Lage ist, die fluoreszierenden Moleküle zu detektieren, die zur Markierung der Antikörper verwendet wurden, die zur Charakterisierung der Zellproben verwendet wurden (siehe Schritt 1.2.20).
- Vergleichen Sie die Zellzusammensetzung vor und nach der magnetischen Zelltrennung.
Anmerkung: In der Regel wird eine Reinheit von ca. 95% CD45.1+CD3- (d.h. T-Zell-depletiertes Knochenmark) Zellen innerhalb des Live Gates erreicht.
- Waschen Sie die T-Zell-depletierten Knochenmarkzellsuspensionen 2x mit PBS-Lösung (450 x g für 5 min bei 4 °C) und resuspendieren Sie schließlich die Zellen in PBS-Lösung, wobei Sie die Zellkonzentration auf 5 x 107 Zellen/ml einstellen. Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion auf nassem Eis auf.
- Den Empfängermäusen werden T-Zell-depletierte Knochenmarkzellen injiziert, die am Vortag bestrahlt wurden (siehe Abschnitt 1.1).
- Stellen Sie die Versuchsmaus in eine auslaufsichere Kammer und leiten Sie eine Anästhesie durch Inhalation von bis zu 4 % Isofluran ein, bis die Maus bewusstlos ist. Bestätigen Sie die Analgesie und den Bewusstseinsverlust, indem Sie den Verlust des Aufrichtreflexes und den anschließenden Verlust des Pedalrückzugsreflexes testen.
- Injizieren Sie 5 x 106 T-Zell-depletierte Knochenmarkzellen (d. h. 100 μl von 5 x 107 Zellen/ml), die PBS-Lösung enthalten, mit einer 1-ml-Spritze, die mit einer 30-G-Nadel ausgestattet ist, intravenös in den retrobulbären Raum, in dem sich die venöse Sinus befindet.
- Tag 2: Transfer von T-Zellen
Anmerkung: Führen Sie die unten beschriebenen Verfahren in einer sterilen Gewebekulturhaube durch und verwenden Sie gefilterte Reagenzien. Verwenden Sie CD45.2 C57Bl/6 (Wildtyp; WT) als Spender für alloreaktive T-Zellen. Die Verwendung von kongenen Markersystemen ermöglicht die Unterscheidung zwischen Empfänger- (CD45.2+ H2kd+ Balb/c-Mäusen) und Spender-Hämatopoetenzelltypen (Knochenmarkzellen: CD45.1+ H2kb+ B6). SJL-Mäuse; allogene T-Zellen: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6-Mäuse).
- Euthanasieren Sie C57Bl/6-Mäuse in Übereinstimmung mit den geltenden institutionellen Richtlinien und Behörden. Betäuben Sie daher Mäuse durch Inhalation mit einer Konzentration von 5% Isofluran. Setzen Sie die Isofluran-Exposition bis 1 Minute nach dem Atemstillstand fort und bestätigen Sie die Euthanasie durch Zervixluxation. Desinfizieren Sie das Fell und die Haut der Maus gründlich mit 70% Ethanol.
- Stellen Sie ein Sieb mit einem 40-μm-Maschensieb auf ein 50-ml-Sammelröhrchen. Entfernen Sie die Milz und legen Sie sie auf das Sieb.
- Zerkleinern Sie die Milz mit einem Spritzenkolben im Sieb. Waschen Sie das Sieb und den Spritzenkolben mit PBS, um alle Splenozyten zu sammeln.
- Die Zellen im 50-ml-Entnahmeröhrchen bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Splenozyten in 3 ml ACK-Lysingpuffer, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Inkubieren Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang. Fügen Sie anschließend 10 mL PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Splenozyten in PBS.
- Zählen Sie die Milzzellen mit einem Hämozytometer. Ein Aliquot von 6 x 106 Zellen wird für die Durchflusszytometrie-Analyse umgeleitet, um das Ausmaß der Reinigung in Schritt 1.3.9 zu bewerten.
- Für eine vollständige CD3+-T-Zellisolierung aus Gesamtsplenozyten verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Zellaufreinigungskit. Isolieren Sie die Milz-T-Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Die Milz-CD3+-T-Zellen, die wie in Schritt 1.3.7 beschrieben isoliert wurden, werden mit einem Hämozytometer gezählt. Bewahren Sie ein Aliquot von 1 x 106 T-Zellen für die durchflusszytometrische Analyse auf.
Anmerkung: Die durchschnittliche Ausbeute an Milz-T-Zellen pro Spendermaus, die durch magnetische Zelltrennung isoliert wurde, reicht von 1,3 x 107 bis 2 x 107 Zellen.
- Bestätigung des Erfolgs der T-Zell-Isolierung durch Durchflusszytometrie. Eine detaillierte Beschreibung des Färbeprotokolls finden Sie in den Schritten 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
- 1 x 106 Splenozyten der Schritte 1.3.6 (vor der magnetischen Zelltrennung) und 1.3.8 (nach der magnetischen Zelltrennung) mit folgenden Antikörpern färben: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) und α-CD8α (53-6.7).
- Die restlichen Zellen aus Schritt 1.3.6 werden als ungefärbte Kontrolle und für die Einzelfärbung mit den jeweiligen Antikörpern verwendet, um das Durchflusszytometer einzurichten.
- Vergleichen Sie die Zellzusammensetzung vor und nach der magnetischen Zelltrennung.
Anmerkung: Es sollte eine Reinheit von ≥95% der CD45.2+CD3+ T-Zellen innerhalb des Lymphozyten-Live-Gates erreicht werden.
- Waschen Sie die T-Zellen 2x mit PBS (450 x g für 5 min bei 4 °C) und resuspendieren Sie die Zellen schließlich in PBS-Lösung, wobei Sie die Zellkonzentration auf 7 x 106 Zellen/ml einstellen. Halten Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis.
- alloreaktive, Milz-T-Zellen (siehe Schritt 1.3.10) in bestrahlte BALB/c-Mäuse injizieren, die zuvor CD45.1+ T-Zell-depletierte Knochenmarkzellen erhalten haben (siehe Schritt 1.2.22).
- Induzieren Sie eine Anästhesie, indem Sie die Versuchsmaus in eine auslaufsichere Kammer legen, in der sie bis zu 4 % Isofluran ausgesetzt ist, bis sie das Bewusstsein verliert. Bestätigen Sie die Analgesie und den Bewusstseinsverlust, indem Sie den Verlust des Aufrichtreflexes und den anschließenden Verlust des Pedalrückzugsreflexes testen.
- 0,7 x 106 alloreaktive CD3+ T-Zellen werden mit einer 1-ml-Spritze injiziert, die mit einer 30-g-Nadel (d. h. 100 μl von 7 x 106 Zellen/ml) ausgestattet ist, die PBS-Lösung enthält (siehe Schritt 1.3.10), intravenös in den retrobulbären Raum der Mäuse injizieren, um die GvHD zu induzieren.
- Injizieren Sie einer anderen Gruppe von Mäusen nur 100 μl PBS intravenös in den retrobulbären Raum und bezeichnen Sie diese Gruppe als Kontrollgruppe, die anschließend als "no-T-Zell-transplantierte (noT) Mäuse" bezeichnet wird.