>1. In vitro Aufreinigung von Sporozoiten aus C. parvum Oozysten
- Reinigen Sie Sporozoiten von C. parvum-Oozysten nach dem Bleichen und Auswaschen des Bleichmittels, wie oben beschrieben.
- Übertragen Sie die Oozysten in ein 15-ml-Röhrchen. Resuspendieren Sie Oozysten in Excystationmedium bei Raumtemperatur (0,75 % w/v Natriumtaurocholat in DMEM), um 1 x 107 Oozysten/ml zu erhalten. Die Zugabe von Taurocholat verbessert die Excystationsrate der Oozysten und verbessert die Sporozoitenausbeute.
- Inkubieren Sie die Oozystensuspension bei 37 °C für 1–1,5 h.
- Überprüfen Sie die Probe mikroskopisch auf das Ausmaß der Excystation; 60–80% Excystation ist für eine gute Wiederfindung von Sporozoiten angemessen. Wenn der Excystationsgrad gering ist, inkubieren Sie länger (weitere 30 min bis 1 h).
- Bestimmen Sie den prozentualen Verbrauch im Verhältnis zur Anzahl der Start-Oozysten. Die Excystation wird wie folgt berechnet:
% Überschreitung = [1 – (Anzahl der intakten Oozysten/Anzahl der Oozysten zu Beginn)] x 100
- Waschen Sie die Zellen, um Excystation-Reagenzien zu entfernen, indem Sie 14 ml PBS oder Medium hinzufügen, mischen und gewinnen Sie Zellen (intakte Oozysten, Oozystenschalen und Sporozoiten) durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 20 Minuten, um Sporozoiten zurückzugewinnen. Aspirieren Sie vorsichtig, um Zellverluste zu vermeiden.
- Resuspendieren Sie das Sporozoit-Pellet in 1–2 ml DMEM, um 3 x 107 Oozysten/ml zu erhalten (basierend auf der Anzahl der Start-Oozysten).
- Um die verbleibenden Oozysten und Schalen zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension durch einen 3-μm-Filter (Abbildung 1B). Verwenden Sie einen 47-mm-Filterhalter, der mit einem Polycarbonatfilter (3 μm Porengröße) ausgestattet ist, der an einem 10-ml-Spritzenzylinder befestigt ist. Setzen Sie den Filterhalter auf ein 15-ml-Röhrchen. Stellen Sie die Baugruppe in einen Eiskübel oder in einen Kühlraum.
- Geben Sie 7,5 mL der Sporozoit-Suspension in die Filteranordnung und lassen Sie sie durch die Schwerkraft durchsickern. Mit weiteren 7,5 mL DMEM.
durchspülen
Anmerkung: Um den Erfolg bei der Sporozoitenisolierung zu gewährleisten, sind frische Oozysten und eine gute Excystation entscheidend. Wenn es zu viele nicht exzystische Oozysten gibt, fließt die Suspension nicht durch die Schwerkraft durch. Durch Druck auf die Spritze können nicht exzystische Oozysten durchgedrückt werden. Die Mikroinjektion von Sporozoiten ist schwieriger als die von Oozysten, da Sporozoiten verklumpen und die Kapillaren blockieren können. Um dies zu vermeiden, empfehlen wir, bei der Injektion von Organoiden mit Sporozoiten eine breitere Kapillarspitze anzubringen. Um ein ausreichendes Infektionsniveau zu erreichen, muss die 2- bis 4-fache Anzahl von Sporozoiten in jedes Organoid injiziert werden, verglichen mit Organoiden, die mit Oozysten infiziert sind.
- Die filtrierte Sporozoit-Suspension wird bei 3.400 x g mit einem schwingenden Schaufelrotor 20 Minuten lang zentrifugiert, um Sporozoiten zu pelletieren.
- Resuspendieren Sie in 50–100 μl OME- oder OMD-Organoid-Kulturmedium (siehe Materialtabelle), ergänzt mit 0,05 % (w/v) Fast Green Farbstoff und L-Glutathion, Betain, L-Cystein, Linolsäure und Taurin-haltigem Reduktionspuffer (siehe Materialtabelle).
Anmerkung: Eine zu lange Inkubation von Oozysten kann zur Lyse von Sporozoiten und einer schlechten Genesung führen und sollte daher vermieden werden.
>2. In-vitro-Kultur des menschlichen Darms für Mikroinjektionen
- Kultur von Darmorganoiden unter Bedingungen von Expansions- und Differenzierungsmedien.
HINWEIS: Die Einzelheiten der Darmvermehrung wurden bereits in anderen Artikeln beschrieben (siehe Materialtabelle für Medienrezepte). Hier beschreiben wir kurz die Organoid-Kulturmethode mit besonderem Bezug auf die Optimierung für die Cryptosporidium-Injektion und das Wachstum. Wir haben festgestellt, dass für die Bildgebung von Parasiten in Organoiden Organoide, die in einem Expansionsmedium gezüchtet wurden, denen in Differenzierungsmedien vorzuziehen sind, da es weniger Ablagerungen gibt als bei Organoiden, die in einem Differenzierungsmedium gezüchtet wurden. Besteht das Ziel jedoch darin, Oozysten zu isolieren, produzieren Organoide, die in Differenzierungsmedien gezüchtet werden, eine weitaus höhere Anzahl von Oozysten.
- Halten Sie Organoide in 3D-Kulturen in extrazellulärer Matrix (siehe Materialtabelle) bei 37 °C. Fügen Sie OME (Organoid-Expansionsmedium) hinzu und aktualisieren Sie sie täglich.
- Um Organoide für die Mikroinjektion zu spalten und zu plattieren, entfernen Sie das Medium von der 6-Well-Platte mit humanen Organoiden, geben Sie F12+++ (siehe Materialtabelle) in die Vertiefung und brechen Sie die Matrix auf, indem Sie mehrmals mit einer 1-ml-Pipettenspitze pipettieren. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen (2 mL F12+++ pro Röhrchen reichen für weitere Eingriffe aus).
- Geben Sie 10–12 mL F12+++ in ein weiteres 15 mL Röhrchen und geben Sie eine Pipette aus feuerpoliertem Glas in das Medium, pipettieren Sie 3 Mal auf und ab, um die menschlichen Darmorganoide aufzubrechen.
Anmerkung: Verwenden Sie eine lange Glaspipette (20–30 cm) und polieren Sie sie kurz. Machen Sie die Öffnung (1 mm Durchmesser) nicht zu klein, da Organoide beschädigt werden können. Machen Sie die Spitze der Pipette glatt, indem Sie sie kurz feuerpolieren. Zerlegen Sie Organoide in kleinere Stücke von ~50 μm.
- F12+++ bis zu 5–7 mL zugeben und bei 350 x g für 5 min.
zentrifugieren
Anmerkung: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit in diesem Schritt ist höher als normal, um ein gutes Zellpellet herzustellen, das gut von der extrazellulären Matrix getrennt ist (siehe Materialtabelle). Wir haben beobachtet, dass menschliche Dünndarm-Organoide im Vergleich zu Dünndarm-Organoiden der Maus schwerer zu zerstören sind.
- Entfernen Sie so viel Medium wie möglich, ohne die Zellen zu stören, und resuspendieren Sie das Pellet dann mit einer Matrix, die bei 4 °C gehalten wird. 200–300 μl Matrix pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte sind erforderlich. Organoide sollten eins zu drei gespalten werden, um eine relativ hohe Zelldichte zu erhalten.
- Plattieren Sie die Organoide in Matrixtröpfchen von jeweils etwa 5–10 μl in der Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. 20–30 Minuten bei 37 °C inkubieren und dann mit dem Erweiterungsmedium (OME) bestreuen.
- Wechseln Sie das Medium alle 2–3 Tage.
Anmerkung: In etwa 5–7 Tagen erreichen Organoide, die in EM wachsen, eine Größe von 100–200 μm und sind bereit für die Injektion.
- Um die Organoide zu differenzieren, wechseln Sie das Medium nach 5-6 Tagen in EM auf die Bedingungen des Differenzierungsmediums (DM) und bewahren Sie es für weitere 5-6 Tage auf, bevor Sie die Parasiten injizieren.
Anmerkung: Für die Expansion von Organoiden wird empfohlen, die Organoide dicht zu plattieren. Für die Mikroinjektion wird die Verwendung einer Sechs-Well-Platte mit Organoiden empfohlen, die mit geringerer Dichte plattiert sind. Zum Beispiel Platten Organoide aus drei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte in eine volle Sechs-Well-Platte für Mikroinjektionen. Die Matrix sollte für die Langzeitlagerung bei -20 °C aufbewahrt und vor der Verwendung bei 4 °C oder auf Eis aufgetaut werden.
>3. Mikroinjektion von Oozysten/Sporozoiten in das Organoid-Lumen
- Mikroinjizieren Sie Parasiten in die apikale Seite des 3D-Organoids (Abbildung 2).
- Bereiten Sie Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 1 mm mit einem Mikropipettenabzieher vor.
Anmerkung: Die am Mikropipettenabzieher verwendeten Einstellungen (siehe Materialtabelle) sind Hitze = 663, Zug = 100, Geschwindigkeit = 200, Zeit = 40 ms. Die Einstellungen müssen gemäß den Benutzeranweisungen für eine bestimmte Maschine angepasst werden.
- Schneide die Spitze der Kapillare mit einer Pinzette ab. Die Größe/der Durchmesser des Kapillarendes misst etwa 9–12 μm; Dies ermöglicht einen einfachen Fluss von Oozysten (4–5 μm Größe).
- Füllen Sie die Kapillaren mit Oozysten- oder Sporozoitensuspension mit Mikroladerspitzen.
- Laden Sie die mit Oozysten gefüllte Kapillare auf einen Mikroinjektor.
- Mikroinjizieren Sie 100–200 nL Suspension in jedes Organoid unter einem inversen Mikroskop bei 5-facher Vergrößerung, wobei der Druck konstant gehalten wird. Nach der Mikroinjektion das Medium täglich mit OME oder OMD (Organoid Differentiation Medium) auffrischen und die Platte auf 37 °C halten
Anmerkung: Wir verwenden keinen Mikromanipulator für die Mikroinjektion. Es wird empfohlen, für das gesamte Experiment die gleiche Kapillare zu verwenden, um eine gleichmäßige Injektion in jeder Probe zu gewährleisten.
