Generierung eines Mausmodells für experimentelle zerebrale Malaria unter Verwendung von Sporozoiten aus der Wirtsmücke

Abstract

Quelle: Hoffmann, A. et al., In Vivo Tracking of Ödema Development and Microvascular Pathology in a model of experimental ceebral Malaria using Magnetic Resonance Imaging.J. Vis. Exp.(2017)

Dieses Video zeigt die Erstellung eines experimentellen Mausmodells für zerebrale Malaria. Sporozoiten, die aus mit Plasmodium berghei infizierten weiblichen Mücken isoliert wurden, werden in die Schwanzvenen einer gefesselten Maus injiziert, was zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einer Gehirnentzündung führt, die zerebrale Malaria verursacht. Dieses infizierte Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der mikrovaskulären Pathologie in vivo im Zusammenhang mit zerebraler Malaria.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Infektion

1. Infizieren Sie Anopheles stephensi-Mücken mit Plasmodium berghei ANKA, indem Sie sie 15 Minuten lang mit einer gametozytenämischen Maus füttern. Halten Sie die infizierten Mücken bei 80 % Luftfeuchtigkeit und 21 °C.
2. Sammeln Sie weibliche Mücken 17 bis 22 Tage nach der Blutmahlzeit aus ihrem Käfig. Lege sie auf Eis, um sie zu betäuben.
3. Legen Sie mit einer Pinzette drei bis vier Mücken auf einen Glasobjektträger, der mit einem Tropfen kaltem RPMI-Medium bedeckt ist. Legen Sie den Objektträger unter ein Mikroskop.
4. Dehnen Sie die Mücke vorsichtig mit einer Pinzette zwischen Kopf und Körper. Isolieren Sie die Speicheldrüse mit einer Spritze und einer Nadel. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Mücken.
5. Sammeln Sie die Speicheldrüsen aus dem Objektträger, indem Sie sie mit einer Glaspipette aufsaugen und in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen sammeln.
   Anmerkung: Abhängig von den Infektionsraten können in der Regel 8.000 bis 15.000 infektiöse Sporozoiten pro Speicheldrüse gewonnen werden.
6. Schlagen Sie die isolierten Speicheldrüsen im Zentrifugenröhrchen ca. 3 Minuten lang mit einem kleinen Plastikstäbchen ein, um die Sporozoiten aus dem Speicheldrüsengewebe zu isolieren.
7. 3 min bei 1.000 x g und 4 °C zentrifugieren, um die Sporozoiten aus dem restlichen Gewebe zu reinigen.
8. Pipettieren Sie den Überstand, der die Sporozoiten (SPZ) enthält, in ein neues Zentrifugenröhrchen und zählen Sie die gereinigten Sporozoiten in einem Neubauer-Hämozytometer.
9. Passen Sie die Konzentration der gereinigten Sporozoiten auf 10.000/ml an, indem Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzufügen.
10. Injizieren Sie insgesamt 1.000 Sporozoiten (0,1 ml) in die Schwanzvenen von Inzuchtmäusen vom Typ C57BL/6, um die Infektion auszulösen. Um die Injektionen zu erleichtern, legen Sie die C57BL/6-Mäuse in einen Beutel und legen Sie die Schwänze in warmes (ca. 37 °C) Wasser, um die Visualisierung der Schwanzvenen zu erleichtern.
    Anmerkung: Die Injektion selbst ist ein kurzer Eingriff, der innerhalb weniger Sekunden durchgeführt werden kann.
11. Kontrollieren Sie ab dem 3. Tag nach der SPZ-Infektion einmal täglich die Parasitämie im Blutstadium auf Blutausstrichen.
12. Beurteilen Sie die Mäuse einmal täglich mit dem Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS)-Score, beginnend mit Tag 5 nach der Sporozoiten-Injektion.
13. Beurteilen Sie die Mäuse mit Magnetresonanztomographie (MRT) gemäß dem Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) Score und der zu bearbeitenden Forschungsfrage.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	Baxter	1001747	für Anästhesie
Dotarem	Guebert	1086923	Gd-DTPA Kontrastmittel; 0,5 mmol/ml
Amira (Bildbearbeitungsprogramm)	FEI Gruppe		Version Amira 5.3.2
MATLAB (Englisch)	Die MathWorks, Inc.,		Ausgabe 2012b
FDT-Werkzeugkasten	Die Software-Bibliothek von FMRIB