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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Makrophagen der bronchoalveolären Lavage (BAL)
- Verwenden Sie BAL, um Lungenmakrophagen bei (1) menschlichen Probanden durch Bronchoskopie und (2) Mäusen durch intratracheale Aspiration zu erhalten.
Anmerkung: Der Erwerb der Makrophagen führt in der Regel zu einer gewissen Aktivierung dieser Zellen. Makrophagen werden von Patienten gewonnen, die eine Bronchoskopie benötigen, um ein potenzielles medizinisches Problem zu untersuchen, und nicht alle Probanden sind möglicherweise für die Analyse von Makrophagen, extrazellulären Fallen oder METs geeignet (dies muss für jedes einzelne Projekt bestimmt werden).
- Nehmen Sie die BAL-Lösung und schleudern Sie sie herunter (500 x g für 10 Minuten), um ein Pellet zu bilden, waschen Sie sie zweimal mit Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit 5 % fötalem Kälberserum und 1 % L-Glutamin) bei Raumtemperatur und verdünnen Sie dann die Zellen in 4 ml Kulturmedium.
- Falls erforderlich, fordern Sie eine formale Differentialzahl an; die meisten Zellen (in der Regel >80%) sind Makrophagen.
Anmerkung: Dies wird in der Regel von einem klinischen Histologiedienst unter Verwendung des morphologischen Erscheinungsbildes der verschiedenen Zelltypen durchgeführt.
- Führen Sie eine lebensfähige Makrophagenzellzählung in der BAL-Lösung mit Trypanblau-Ausschluss und einem Hämozytometer durch.
Anmerkung: Die BAL-Lösung wird aus Menschen und Mäusen gewonnen, wie in Schritt 1.1 erwähnt.
- 1 - 4 x 105 Makrophagen auf 24-Well-Platten auf Deckgläsern in 500 μl Kulturmedium pro Vertiefung geben und über Nacht bei 37 °C belassen; die Zellen haften an den Deckgläsern. Bei menschlichen Proben sind Antibiotika (z. B. Penicillin und Streptomycin, 104 U/ml) zuzugeben, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern.
>2. Immunfluoreszenzmarkierung/Mikroskopie von BAL-Makrophagen
HINWEIS: Zellen werden wie oben erwähnt auf Deckgläser geklebt.
- Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in 2 % Paraformaldehyd/Periodat/Lysin (PLP)-Fixiermittel.
- Die Zellen kurz in PBS waschen und dann 20 Minuten lang in 0,2 % Tween 20 in PBS permeabilisieren.
- Blockzellen mit 10 % Hühnerseren in 5 % Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt in PBS für 30 Minuten.
- Inkubieren Sie mit Primär- und Isotyp-Kontrollantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur bei Konzentrationen von 1:100 (genauere Details sind in der Materialtabelle aufgeführt) bei 37 °C.
Anmerkung: Für die BAL-Proben ist in der Regel kein spezifischer Marker von Makrophagen erforderlich.
- Nach der Zugabe von Primärantikörpern waschen Sie die Zellen in PBS und inkubieren Sie mit den entsprechenden Sekundärantikörpern 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Schnitte in PBS und mounten Sie sie mit einem DAPI-basierten Einbettmedium zur Visualisierung mit einem konfokalen Mikroskop (wie oben erwähnt) bei den Laseranregungen 405, 488, 561 und 647 nm und einem 40X, 1,0 NA Ölobjektiv.