>1. Sprühinokulation mit einer Suspension von M. grisea Konidien
- Pilzkultur für M.grisea
- Bereiten Sie das Haferflocken-Tomaten-Agar-Nährmedium (OTA) für Pilzstämme vor.
- Wiegen Sie 30 - 50 g Haferflocken, geben Sie diese in 800 mL destilliertes/deionisiertes Wasser (ddH2O) und kochen Sie die Mischung 30 min lang im elektrischen Topf.
- Den gekochten Haferflockensaft durch ein Stück Gaze in den Becher filtrieren.
- 150 mL Tomatensaft und 20 g Agar zum Filtrat im Becherglas geben und ddH2O bis zu 1.000 mL zugeben.
- Aufbereitung von Versuchsmaterialien
- Weichen Sie etwa 50 Samen Reis (Oryza sativa) der Sorte Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O für 3 d ein oder weichen Sie etwa 50 Samen Gerste (Hordeum vulgare cv Golden Promise) in ddH2O für etwa 1 Tag ein.
- Die Samen von Reis oder Gerste in feuchte Gaze einwickeln und auf feuchtem Filterpapier in ca. 30 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm x 10 cm bei 28 °C keimen lassen. Die Keimzeit der Reissamen beträgt etwa 2 - 3 Tage und die Keimzeit der Gerstensamen etwa 2 Tage. Die relative Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus beträgt ca. 70%.
- Pflanzen Sie die Setzlinge des Reises oder der Gerste in Töpfe mit autoklavierierter Blumenerde und Gießen und bedecken Sie sie dann mit einer Schicht Vermiculit.
- Stellen Sie die Pflanzen für ca. 1 ~ 2 Wochen in ein geeignetes Gewächshaus oder einen Zuchtschrank bei 25 °C.
- Schneiden Sie mit einer sterilen OP-Schere 3 Lagen Filterpapier in Kreise ein (jeder Kreis sollte einen Durchmesser von 8 cm haben) und legen Sie diese auf 100 mm sterile Kunststoffplatten.
- Geben Sie ddH2O in jede Schale, um das Filterpapier einzuweichen.
- Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier vollständig nass ist, aber fügen Sie kein zusätzliches Wasser hinzu.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einer Vakuumpumpe.
- Legen Sie 2 sterile Zahnstocher in die Kulturschale, um die Reis-/Gerstenblätter zu stützen; platzieren Sie die Zahnstocher in einem Abstand von ~2 - 3 cm.
- Sammeln Sie die Blätter des Reises 2 Wochen nach der Aussaat der Samen oder nehmen Sie die Blätter der Gerste 7 Tage nach der Aussaat der Samen.
- Schneiden Sie mit 4- bis 6-blättrigen Reis-/Gerstensämlingen den unteren Teil des Stängels in ~5 cm Entfernung von der Spitze ab und sammeln Sie die Blätter.
- Protokoll der Sprühimpfung
- Kultivieren Sie den Pilzstamm auf OTA-Platten in einem thermostatischen Inkubator (25 °C) für ~4 Tage.
- Geben Sie ~2 mL ddH2O mit einer 0,5 - 5 mL Pipette auf jede 4 Tage alte Platte.
- Kratzen Sie mit einer Impfschlaufe die Myzelien des M. grisea-Wildtyp-Stammes und des mutierten Stammes in Myzelreste ein.
- Sammeln Sie die Myzel-Rückstände und übertragen Sie sie auf eine neue OTA-Platte. Nehmen Sie die Myzelreste und föhnen Sie sie auf der sauberen Bank.
- Decken Sie die Platte mit 3 Schichten Gaze ab, um die für das Wachstum der Konidien im Gewächshaus erforderliche Feuchtigkeit bei 25 °C tagsüber (14 h) und 23 °C nachts (10 h) für 24 - 48 h zu gewährleisten.
- Geben Sie 2 ml ddH2O in jede Schale und kratzen Sie die Konidien vorsichtig mit sterilen Wattestäbchen ab, gefolgt von einer Filtration durch 2 Schichten Linsenpapier. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Nährmediums nicht zu zerkratzen.
- Übertragen Sie die Konidiensuspension in ein neues 50-ml-Röhrchen mit einer 100 - 1.000 μL-Pipette.
- 5 min bei mindestens 5.000 x g bei 25 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, um 2 x 104 Konidien pro ml in einer 0,025 % (v/v) Tween-20-Lösung zu erhalten. Die Tween-20-Lösung hat normalerweise etwa 10 - 20 mL.
- Gießen Sie die Sporensuspension in ein Handsprühgerät.
- Kastrieren Sie etwa 10 mL der Konidiensuspension auf die Reisblätter von 2 Wochen alten Reissämlingen oder Gerstenblätter von 7 Tage alten Gerstensämlingen und inkubieren Sie sie bei 25 °C in einer dunklen, feuchten Kammer für ~24 h. Besprühen Sie die Kontrollpflanzen mit der 0,025%igen (v/v) Tween-20-Lösung.
- Die Blätter in eine weitere feuchte Kammer unter Leuchtstoffröhrenlicht bei 25 °C für eine Photoperiode von 12 h geben.
- Erfassen Sie die Krankheitssymptome 5 Tage nach der Impfung. Untersuchen Sie die kranken Reis-/Gerstenklingen von ~6 cm Länge. Der Bewertungsstandard orientiert sich an dem Bewertungssystem für Explosionsbeständigkeit des International Rice Research Institute (IRRI). Die Einzelheiten des Scoring-Systems für die Explosionsbeständigkeit sind in Tabelle 1 dargestellt.
- Fotografieren Sie die Blätter, um die Infektion der getesteten Stämme zu bewerten. Die Infektion wurde anhand der Anzahl der Läsionen pro 3,6 cm2 beurteilt.
Tabelle 1: Ein Punktesystem für die Explosionsbeständigkeit. Die Tabelle wird vom International Rice Research Institute (IRRI) zitiert.
| Maßstab | Beschreibung |
| 1 | Kleine braune Flecken von punktgenauer Größe |
| arabische Ziffer | Kleine rundliche bis leicht längliche, nekrotische graue Flecken von etwa 1-2 mm Durchmesser, mit deutlichem braunem Rand. Läsionen sind vor allem an den oberen Blättern zu finden |
| 3 | Der Läsionstyp ist derselbe wie bei 2, aber eine signifikante Anzahl von Läsionen befindet sich auf den oberen Blättern |
| 4 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, die weniger als 4 % der Blattfläche infizieren |
| 5 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, die weniger als 4-10 % der Blattfläche infizieren |
| 6 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, die weniger als 11-25 % der Blattfläche infizieren |
| 7 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, die weniger als 26-50 % der Blattfläche infizieren |
| 8 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, die weniger als 51-75% der Blattfläche infizieren, viele Blätter abgestorben |
| 9 | Typische anfällige Blastenläsionen, 3 mm oder länger, infizieren mehr als 75 % der Blattfläche |
