>1. Pilzkultur für M.grisea
- Bereiten Sie das Haferflocken-Tomaten-Agar-Nährmedium (OTA) für Pilzstämme vor.
- Wiegen Sie 30 - 50 g Haferflocken, geben Sie diese in 800 mL destilliertes/deionisiertes Wasser (ddH2O) und kochen Sie die Mischung 30 min lang im elektrischen Topf.
- Den gekochten Haferflockensaft durch ein Stück Gaze in den Becher filtrieren.
- 150 mL Tomatensaft und 20 g Agar zum Filtrat im Becherglas geben und ddH2O bis zu 1.000 mL zugeben.
>2. Vorbereitung von experimentellen Materialien
- Weichen Sie etwa 50 Samen Reis (Oryza sativa) der Sorte Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O für 3 d ein oder weichen Sie etwa 50 Samen Gerste (Hordeum vulgare cv Golden Promise) in ddH2O für etwa 1 Tag ein.
- Die Samen von Reis oder Gerste in feuchte Gaze einwickeln und auf feuchtem Filterpapier in ca. 30 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm x 10 cm bei 28 °C keimen lassen. Die Keimzeit der Reissamen beträgt etwa 2 - 3 Tage und die Keimzeit der Gerstensamen etwa 2 Tage. Die relative Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus beträgt ca. 70%.
- Pflanzen Sie die Setzlinge des Reises oder der Gerste in Töpfe mit autoklavierierter Blumenerde und Gießen und bedecken Sie sie dann mit einer Schicht Vermiculit.
- Stellen Sie die Pflanzen für ca. 1 ~ 2 Wochen in ein geeignetes Gewächshaus oder einen Zuchtschrank bei 25 °C.
- Schneiden Sie mit einer sterilen OP-Schere 3 Lagen Filterpapier in Kreise ein (jeder Kreis sollte einen Durchmesser von 8 cm haben) und legen Sie diese auf 100 mm sterile Kunststoffplatten.
- Geben Sie ddH2O in jede Schale, um das Filterpapier einzuweichen.
- Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier vollständig nass ist, aber fügen Sie kein zusätzliches Wasser hinzu.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einer Vakuumpumpe.
- Legen Sie 2 sterile Zahnstocher in die Kulturschale, um die Reis-/Gerstenblätter zu stützen; platzieren Sie die Zahnstocher in einem Abstand von ~2 - 3 cm.
- Sammeln Sie die Blätter des Reises 2 Wochen nach der Aussaat der Samen oder nehmen Sie die Blätter der Gerste 7 Tage nach der Aussaat der Samen.
- Schneiden Sie mit 4- bis 6-blättrigen Reis-/Gerstensämlingen den unteren Teil des Stängels in ~5 cm Entfernung von der Spitze ab und sammeln Sie die Blätter.
>3. Verwundungsimpfung mit Myzelwürfeln oder Tröpfchen konidialer Suspension von M. grisea
- Kratzen Sie mit einer anatomischen Nadel drei 2 - 3 cm lange Wunden in die Hauptadern der abgelösten Reis-/Gerstenblätter, achten Sie darauf, dass sie nicht in die Blätter eindringen.
- Legen Sie die abgeschabten Blätter auf Zahnstocher und sprühen Sie eine 0,02%ige (v/v) Tween-20-Lösung auf die Blätter, um eine Tröpfchenschicht zu bilden.
- Schneiden Sie für jeden M. grisea-Stamm (Wildtyp-, Mutanten-, Komplementstämme oder andere Teststämme) einen 0,5 cm x 0,5 cm großen Myzelpfropfen aus einer OTA-Platte.
- Geben Sie die Myzelpfropfen oder 25 μl Tröpfchen Konidiensuspension auf die verwundeten Blätter und inkubieren Sie die Blätter bei 25 °C in einer feuchten Kammer für 3 - 8 Tage.
- Untersuchen Sie die Läsionen 5 - 7 Tage nach der Inokulation. Die Untersuchungsmethode ist die gleiche wie bei der Sprühimpfung (siehe Schritt 1.3.13).
- Untersuchen Sie die erkrankten Reis-/Gerstenklingen von ~6 cm Länge und fotografieren Sie sie, um die Infektion der getesteten Stämme zu bewerten. Die Infektion wurde anhand der Anzahl der Läsionen pro 3,6 cm2 beurteilt.
