>1. Produktion von rekombinantem HBV, das für das Reporterprotein kodiert
- Aufbereitung von HepG2-Zellen
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium oder DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 U/ml nichtessentiellen Aminosäuren).
- Teller 4 x 106 HepG2-Zellen in einer 10 cm dicken, mit Kollagen beschichteten Schale in 10 ml Kulturmedium am Tag vor der Transfektion. Inkubieren Sie HepG2-Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator.
Anmerkung: Wenn etwa 4 x 106 HepG2-Zellen in einer 10 cm dicken, mit Kollagen beschichteten Schale in 10 ml Kulturmedium plattiert werden, sind sie am nächsten Tag zu 70-90 % konfluent.
- Transfektion
- Transfizieren Sie HepG2-Zellen mit 5 μg pUC1.2HBV (Hepatitis-B-Virus), delta epsilon und 5 μg pUC1.2HBV/NL15 unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Entfernen Sie am nächsten Tag den Nährboden und fügen Sie 10 ml frischen Nährboden hinzu.
- Eine Woche nach der Transfektion wird das Kulturmedium mit dem rekombinanten HBV in ein 50-ml-Röhrchen überführt und mit Schritt 1.3.1 fortgefahren. 10 ml frisches Nährmedium werden in die Platte mit den transfizierten Zellen gegeben.
Anmerkung: Die Produktion des rekombinanten HBV wird 4 Wochen lang aufrechterhalten. Das Kulturmedium, das rekombinantes HBV enthält, kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
- Reinigung von rekombinantem HBV
- Entfernen Sie Zelltrümmer aus dem Kulturmedium, das rekombinantes HBV enthält, durch Zentrifugation (2.300 x g für 5 Minuten).
- Der Überstand wird durch einen 0,45 μm Membranfilter geleitet.
- Geben Sie ein gleiches Volumen von 26 % PEG/1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure) (pH 7,6 in 500 ml) in das Kulturmedium mit rekombinantem HBV und mischen Sie es vorsichtig. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Zentrifugieren Sie bei 2.300 x g für 20 min bei 4 °C.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) auflösen.
- Entfernen Sie die Ablagerungen durch Zentrifugation bei 2.300 x g für 5 min.
- Laden Sie 0,5 ml TNE-haltiges rekombinantes HBV auf 0,8 ml 20%ige Saccharose in TNE.
- Zentrifugieren Sie bei 100.000 × g für 3 Stunden bei 15 °C.
- Entsorgen Sie so viel Überstand wie möglich und bewahren Sie das Pellet auf. Resuspendieren Sie es in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Ausgangskulturmedium.
- Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Filtern Sie durch einen 0,45 μm Filter. 0,5 ml Aliquots zubereiten und bei -80 °C lagern.
Anmerkung: Wenn eine Reporterproteinkontamination der ursprünglichen Virusprobe beobachtet wird, reinigen Sie das Virus durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von 5-30 % Saccharose in TNE bei 100.000 x g für 2 Stunden oder CsCl-Dichteäquilibrierte Zentrifugation von 1,1 bis 1,6 g/ml bei 150.000 x g für 50 Stunden.
>2. Infektion von rekombinantem HBV
- Kultur von HepG2-Zellen, die stabil NTCP (Natriumtaurocholat-co-transportierendes Polypeptid) (HepG2/NTCP) exprimieren und anfällig für eine HBV-Infektion in DMEM sind, ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 250 μg/ml G-418 (Geneticin) und 100 U/ml nichtessentiellen Aminosäuren bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator.
- Einen Tag vor der Infektion ca. 5 x 104 HepG2/NTCP-Zellen in eine kollagenbeschichtete 96-Well-Platte in 0,1 ml Kulturmedium füllen.
- Tauen Sie rekombinantes HBV in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, bis sich noch etwas Eis in der Durchstechflasche befindet.
- Bereiten Sie das Medium für die Infektion vor, indem Sie Folgendes kombinieren:10 μl 40 % PEG8000 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 μl Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 μl rekombinantes HBV und 78 μl frisches Kulturmedium pro Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Geben Sie 100 μl rekombinante HBV-Lösung in eine Vertiefung der 96-Well-Platte.
- Einen Tag nach der Infektion waschen Sie die infizierten Zellen 3 Mal mit 300 μl PBS pro Vertiefung, um das kontaminierende Reporterprotein aus der Virusfraktion zu entfernen.
- Inkubieren Sie infizierte Zellen in 200 μl Kulturmedium mit 2 % DMSO für eine Woche oder weniger.
>3. Analyse
- Eine Woche nach der Infektion waschen Sie die infizierten Zellen 3 Mal mit PBS.
- Geben Sie 50 μl Lysepuffer zu den infizierten Zellen.
- Schütteln Sie die Kulturplatte 5 Minuten lang und zentrifugieren Sie sie dann 5 Minuten lang bei 2.000 x g.
- Geben Sie 50 μl des Reportersubstrats in die Luminometerplatte.
- 20 μl Zelllysat werden auf eine Luminometerplatte gegeben, die das Reportersubstrat enthält. Durch kurzes Vortexen mischen.
- Legen Sie die Platte in das Luminometer und starten Sie die Messung.
