Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
>1. Erforderliche Lösungen
- Bereiten Sie 150 mg/L (für die Anästhesie) oder 300 mg/L (für die Euthanasie) Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat-Lösung (MS-222) mit Wasser aus dem Aquarium vor, in dem die Zebrafische gehalten werden. Füllen Sie einen kleinen Tank mit 1 l Anästhesielösung und halten Sie ihn belüftet.
- Füllen Sie ein weiteres kleines Becken mit 1 l Aquarienwasser ohne MS-222 für die Fischerholung und halten Sie es belüftet.
- Stellen Sie 50 ml 1x PBS aus einer 10x sterilen Stammlösung her.
- Für die zytometrische Analyse/Isolierung von Darmzellen ist ausreichend frische 0,15%ige Kollagenase-Typ-IV-Lösung für 1 ml pro Fisch aus einer Stammlösung oder aus Pulver in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 1 % v/v Penicillin und Streptomycin herzustellen (siehe Materialien). Aliquote (1 pro Fisch) von 1 ml in 2-ml-Zentrifugenröhrchen herstellen. Bei 4 °C bis 30 min vor dem Präparieren aufbewahren.
- Für die konfokale Mikroskopie/Probenfixierung bereiten Sie 50 ml frische 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in PBS vor oder tauen Sie eine Stammlösung aus einem -20 °C-Gefrierschrank in einem Abzug auf.
Vorsicht: PFA ist giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie damit arbeiten. Handschuhe und eine Schutzbrille sollten getragen werden und Lösungen sollten immer in einem Abzug gelassen werden.
2. Vorbereiten der Ausrüstung für die orale Intubation
- Legen Sie ca. 1 cm eines feinen Silikonschlauchs auf eine 31 g Luer-Lock-Nadel, um die Nadelspitze zu bedecken.
- Schneiden Sie eine 10 μl Sterilfilter-Pipettenspitze (ca. 2 cm) ab, nehmen Sie das feinere Ende und legen Sie es als Scheide über den Silikonschlauch. Stellen Sie sicher, dass die Pipette über die Nadelspitze hinausragt, um Verletzungen des Tieres zu vermeiden.
- Befestigen Sie die Nadel an einer 100 μl Luer-Lock-Spritze.
Anmerkung: Zwischen den Behandlungen immer gründlich mit Ethanol und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, siehe Materialien) spülen.
>3. Vorbereiten der Fluoreszenz-Nanopartikel-Suspension
- Markieren Sie das Protein-Nanopartikel mit Atto-488 NHS-Ester (siehe Materialtabelle) oder einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Resuspendieren Sie die Nanopartikel in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer in einer Konzentration von 2 mg/ml.
- Lösen Sie den Atto 488 NHS-Ester in aminfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 2 mg/ml. Halten Sie ein Aliquot von 10 μl bereit, um die Wirksamkeit der Markierung zu überprüfen.
- Mischen Sie die Nanopartikel und den Atto 488 NHS-Ester im molaren Verhältnis 1:2 (Protein: Farbstoff) durch Rühren im Dunkeln.
- Schleudern Sie die markierten Nanopartikel durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur herunter, entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie ihn auf, um die Wirksamkeit der Markierung zu überprüfen.
- Waschen Sie die markierten Nanopartikel, indem Sie sie in 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer resuspendieren, indem Sie sie vortexen und auf und ab pipettieren. Anschließend wird der Überstand durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur verworfen. Wiederholen Sie Schritt 3.6 5 Mal.
- Das Pellet wird in 5 mL 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen resuspendiert und Aliquote des fluoreszierenden Nanopartikels in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (30 Aliquote) hergestellt. Bei 8.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunterschleudern, den Überstand entsorgen und bei -80 °C lichtgeschützt lagern.
4. Zebrafisch-Anästhesie und orale Intubation
- Fasten Sie den Fisch (>0,5 g) mindestens 48 Stunden vor dem Versuch, um den Darm zu entleeren.
- Bringen Sie den Fisch (12 Fische) eine Nacht vor dem Experiment in die Versuchsbecken (6 L), um die Akklimatisation zu ermöglichen12.
- Ziehen Sie die Nanopartikellösung gut vor (z. B. 2.500 U/min und 30 s) und ziehen Sie das gewünschte Volumen der Nanopartikelsuspension (z. B. 20–50 μl) in die Spritze auf, die an der geschützten Nadel befestigt ist.
- Legen Sie den Fisch in die belüftete 150 mg/L MS-222-Lösung (siehe Abschnitt 1), bis er auf den Boden des Tanks sinkt und nicht auf ein Einklemmen der Schwanzflosse reagiert; dieser Vorgang dauert weniger als 5 Minuten.
- Setzen Sie den betäubten Fisch schnell mit einem Netz in eine nasse Plastikschale um, richten Sie das Tier horizontal zur Nadel aus und beginnen Sie sofort mit der oralen Intubation.
- Stützen Sie den Fisch vorsichtig mit einer Hand ab und öffnen Sie mit der anderen Hand das Maul mit der geschützten Nadel. Führen Sie die Nadel vorsichtig bis zu einem Abstand von etwa 1 cm von der Mundöffnung in die Speiseröhre ein.
Anmerkung: Der Bediener kann einen leichten Widerstand spüren, wenn das Ende der Pipettenspitze die Kieme passiert hat. Achten Sie darauf, den Nadeleintritt nicht zu stark zu verwinkeln, da dies die Kieme perforieren könnte.
- Injizieren Sie die Nanopartikelsuspension langsam in den Fisch. Stellen Sie sicher, dass die Suspension nicht durch die Kiemen oder das Maul nach außen fließt.
- Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und legen Sie den Fisch in das Auffangbecken (siehe Abschnitt 1). Die Wiederherstellung dauert in der Regel 1 Minute.
- Untersuchen Sie den Fisch sorgfältig auf Anomalien (z. B. Blutungen an den Kiemen sind ein Zeichen für eine Perforation).
- Sobald sich die Fische erholt haben, setzen Sie sie in die Versuchsbecken zurück.
