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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tiere anästhesieren, intubieren und impfen
HINWEIS: Empfohlen werden spezifisch pathogenfreie (SPF) immunkompetente männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 100 - 120 g. Versorgen Sie alle Tiere ad libitum mit Futter und Wasser und halten Sie sie sozial auf Holzspänen oder anderer saugfähiger Einstreu mit dem üblichen 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus.
- Besorgen und sterilisieren Sie vor der Durchführung von Versuchen eine Metallkanüle und einen Polyethylenschlauch in der für die Tierart geeigneten Größe. Besorgen Sie sich sterile 1-ml-Einmalspritzen und sterile 25-Gauge-Einwegnadeln.
Vorsicht: Entsorgen Sie diese Spritzen und Nadeln immer in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
- Für Ratten kaufen oder fertigen Sie eine Metallkanüle mit einer Länge von ca. 12 cm, einem Innendurchmesser von 0,9 - 1,0 mm und einem Außendurchmesser von 1,0 - 1,2 mm und ist an einem Ende in einem Winkel von ca. 45° gebogen. Schneiden Sie einen 11 bis 12 Zoll langen Polyethylenschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,4 mm und einem Außendurchmesser von 0,8 mm. (Siehe Abbildung 1A.)
- Legen Sie die Metallkanüle in ein Glas, ein Schraubröhrchen und autoklavieren Sie sie mit den Standardmethoden zur Sterilisation. Weiche die abgeschnittenen Stücke des Polyethylenschlauchs ein und bewahre sie in einem abgedeckten Becherglas mit Alkohol auf.
- Bereiten Sie die Arbeitsfläche und das Intubationsgerät vor.
- Legen Sie eine saubere Einwegmatte auf die Arbeitsfläche in der Nähe des Wasserbads. Übertragen Sie die Metallkanüle in ihrem Glasaufbewahrungsröhrchen auf diese Oberfläche. Entfernen Sie die Kappe vom Aufbewahrungsschlauch und schieben Sie das Griffende der Kanüle an das offene Ende des Schlauchs.
- Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette ein Stück Polyethylenschlauch aus dem Becherglas und führen Sie ihn durch das Innere der sterilen Metallkanüle ein, wobei Sie darauf achten, dass er sich frei bewegt. Setzen Sie eine sterile Einwegnadel mit 25 Gauge (für Ratten) auf das freie Ende des Polyethylenschlauchs ein, indem Sie die Nadel einige mm in den Schlauch schieben. (Siehe Abbildung 1A für Ratte).
- Platzieren Sie Leitmarkierungen sowohl auf der Metallkanüle als auch auf dem Polyethylenschlauch, um die Einführtiefe beim Tier anzuzeigen, indem Sie das unten beschriebene Intubationsverfahren an einem einzelnen euthanasierten Tier befolgen. Öffnen Sie die Brusthöhle zur Beobachtung, platzieren Sie dann die Metallkanüle richtig und schieben Sie den Polyethylenschlauch entsprechend vor. Markieren Sie die Metallkanüle mit einem unauslöschlichen Stift an der Stelle, an der sie auf das Maul des Tieres trifft, und den Polyethylenschlauch an der Stelle, an der sie auf die Oberseite der Metallkanüle trifft, um die richtige Platzierung bei den übrigen Tieren zu erleichtern.
- In einem Abzug (oder unter Verwendung eines geeigneten Spülsystems) werden bis zu 6 Tiere gleichzeitig in einer geschlossenen Kammer mit ≤5 % Isofluran in 1,5 l/min Sauerstoff betäubt, bis der Würgereflex gehemmt ist (ca. 1 min).
Anmerkung: Vor der Durchführung von Versuchen ist die sichere Dosis und Expositionszeit für Isofluran unter den verwendeten spezifischen Bedingungen (z. B. Größe/Art der Kammer und Größe/Spezies/Stamm des Tieres) festzulegen, um eine versehentliche letale Exposition zu verhindern.
- Füllen Sie eine sterile 1-ml-Einwegspritze (für Ratten) mit steriler Kochsalzlösung, indem Sie die sterile Spitze in die Kochsalzlösung stecken und auf den Kolben zurückziehen. Befestigen Sie die Spritze an der Nadel, die auf dem Polyethylenschlauch angebracht ist, und spülen Sie das gesamte Volumen der Kochsalzlösung durch den Schlauch, bis die Spritze entleert ist.
- Füllen Sie die Spritze mit dem Inokulum auf Agarbasis aus dem Behälter im Wasserbad und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, bis der Schlauch grundiert ist (z. B. vollständig mit dem Agar gefüllt).
- Bei Ratten entfernen Sie die 25-Gauge-Nadel (die auf dem Polyethylenschlauch angebracht ist) aus der Einwegspritze. Entsorgen Sie die gebrauchte Spritze in einem Behälter für scharfe Gegenstände. Füllen Sie eine neue, sterile 1 mL Einwegspritze mit dem Agar-basierten Inokulum aus dem Behälter im Wasserbad, indem Sie die sterile Spitze in das Inokulum stecken und den Kolben zurückziehen. Befestigen Sie die Nadel (die auf dem Polyethylenschlauch angebracht ist) wieder und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, indem Sie den Kolben drücken, bis der Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist.
- Nehmen Sie ein Tier aus der Narkosekammer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf die Einwegmatte, mit dem Kopf nach rechts und dem Schwanz nach links, wie in Abbildung 1C gezeigt.
- Intubieren Sie das Tier mit dem Intubationsgerät (d. h. der Metallkanüle mit einem Polyethylenschlauch) und führen Sie die Kanüle in den großen Lappen der linken Lunge ein (siehe Abbildung 1D).
- Führen Sie das freie Ende der Metallkanüle in das Maul des Tieres ein. Drehen Sie die Kanüle so, dass das freie Ende nach oben abgewinkelt ist, und schieben Sie sie vorsichtig in die Luftröhre ein, wobei Sie die Kehlkopfstrukturen vorsichtig mit einer leichten Drehbewegung umgehen. Bestätigen Sie das Einführen in die Luftröhre im Gegensatz zur Speiseröhre, indem Sie die Kanüle mehrmals leicht nach vorne und hinten schieben, während Sie die Trachealringe mit dem linken Zeigefinger abtasten, wie in Abbildung 1C gezeigt.
- Wenn die Kanüle die Bifurkation erreicht, an der sich die Luftröhre in die linke und die rechte Bronchie aufteilt, machen Sie eine leichte Drehbewegung zur linken Seite des Tieres, um sicherzustellen, dass die Kanüle in den linken Bronchus eingeführt wird. Schieben Sie die Metallkanüle vor, bis sich das Ende auf halbem Weg zu drei Vierteln der linken Lunge befindet, und bestätigen Sie mit der zuvor angebrachten Führungsmarkierung, dass die entsprechende Tiefe erreicht ist.
- Wenn die Metallkanüle eingesetzt ist, schieben Sie den Polyethylenschlauch einige mm vor. Verwenden Sie die zuvor angebrachte Führungsmarkierung auf dem Schlauch, um sicherzustellen, dass er nur weit genug vorgeschoben ist, um das Ende der Metallkanüle zu verlassen und die Lunge nicht zu durchstechen.
- Wenn beide Kanülen an Ort und Stelle sind, verwenden Sie die beigefügte Spritze, um 100 μl (für Ratten) der Agarsuspension tief in den großen Lappen der linken Lunge zu injizieren (siehe Abbildung 1D). Ziehen Sie einige mm des Polyethylenschlauchs zurück und entfernen Sie dann vorsichtig das intakte Intubationsgerät. Setzen Sie es wieder in das Glasvorratsrohr und setzen Sie das Tier in einen frischen Käfig, damit es sich erholen kann.
