Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Zubereitung von Tränendrüsenextrakt
HINWEIS: Ratten wurden mit der intraperitonealen Injektion von Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert. Die richtige Anästhesie wurde durch Einklemmen der Zehen und des Schwanzes bestätigt. Ophthalmisches Gel wurde auf die Augen der Ratte aufgetragen, um Trockenheit nach jedem Eingriff zu verhindern. Die anästhesierten Ratten wurden unter Ferninfrarotlicht gesetzt, um die Tiere warm zu halten, bis sie sich vollständig erholt hatten. Während der Eingriffe und der Erholungszeit wurden die Tiere von den Forschern genau überwacht. Alle Materialien und chirurgischen Instrumente waren vor dem Gebrauch steril. Am Ende des Experiments wurden die Ratten durch die intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (80 mg/kg) euthanasiert. Die vollständige Euthanasie wurde durch das Fehlen des Herzpulses und den fehlenden Blinzelreflex bei Berührung des Augapfels bestätigt. Die Ratten wurden unter Standardbedingungen untergebracht: Raumtemperatur, 21-23 °C; relative Luftfeuchtigkeit, 30-70%; Hell-Dunkel-Zyklus, abwechselnd 12 h (7 bis 19 Uhr).
- Setzen Sie die euthanasierten weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (Altersspanne zwischen 8 Wochen und 16 Wochen) flach hin, mit einem Ohr gegen den Tisch und dem anderen nach oben. Machen Sie mit einer Federschere einen 10-mm-Schnitt von oben-unten unter dem freiliegenden Ohr. Entfernen Sie die Tränendrüse, indem Sie sie aus dem umgebenden Bindegewebe und aus dem Abflusskanal präparieren.
- Lagern Sie die Drüsen bis zur Verwendung bei -80 °C. Tauen Sie die Drüsen auf Eis auf. Auf Eis mit einer Schere so fein wie möglich hacken. 150 μl PBS mit 1x Proteasehemmer pro Tränendrüse zugeben.
- Beschallen Sie die Proben 5 Minuten lang auf Eis bei 20 kHz, wobei der Ultraschallator auf 10 s ein und 10 s aus bei 30 % Amplitude eingestellt ist. Zentrifugieren Sie die beschallten Proben für 20 min bei 13.000 x g und 4 °C.
- Pipettieren Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen. Aliquotieren Sie den Überstand in 1,5-ml-Röhrchen und lagern Sie diese bei -80 °C. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
>2. Zubereitung von Emulsion und Pertussis Toxin
- Emulsion
- 40 mg hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis H37Ra in 10 ml vollständiges Freund-Adjuvans mit 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra geben und gut mischen.
Anmerkung: Das endgültige vollständige Freund-Adjuvans enthält 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Wiegen Sie das Ovalbumin, lösen Sie es in PBS auf und bereiten Sie eine Antigenmischung vor, die 2 mg/ml Ovalbumin und 10 mg/ml Tränendrüsenextrakt enthält. Mit dem Ziel eines Injektionsvolumens von 200 μl für jedes Tier ist eine Mastermischung auf der Grundlage der Tierzahlen herzustellen.
- Übertragen Sie ein unvollständiges Freund-Adjuvans oder ein vollständiges Freund-Adjuvans auf ein 50-ml-Röhrchen und stellen Sie sicher, dass das Volumen des Adjuvans an das Antigengemisch in einem Verhältnis von 1:1 steht. Geben Sie das Antigengemisch Tropfen für Tropfen zum Adjuvans, während Sie mit höchster Geschwindigkeit vortexen, damit es nicht zu einem Verschütten kommt. Fahren Sie mit dem Vortexen für 5 Minuten fort, nachdem das gesamte Antigen hinzugefügt wurde.
- Übertragen Sie die Emulsion auf eine 5-ml-Spritze und verbinden Sie sie über einen Spritzenanschluss mit einer anderen 5-ml-Spritze. Schieben Sie die Emulsion von einer Spritze in die andere, um sie zu mischen.
Anmerkung: Die Emulsion ist fertig, wenn ein einzelnes Tröpfchen als Kugel zurückbleibt, wenn es in Wasser gelegt wird. Es sollte nur eine frisch zubereitete Emulsion oder eine über Nacht bei 4 °C gelagerte Emulsion verwendet werden.
- Pertussis-Toxin
- 50 μg Pertussis-Toxin in 500 μl Wasser rekonstituieren, um eine Endkonzentration von 100 ng/μl zu erreichen. Votex den Behälter 30 Sekunden lang, um sicherzustellen, dass sich das Toxin vollständig auflöst.
Anmerkung: Nicht durch Filtration sterilisieren, da dies zu Materialverlust führt. Nicht einfrieren. Diese Lösung bleibt mindestens 6 Monate bei 4 °C aktiv.
- Verdünnen Sie 100 ng/μl Pertussis-Toxin mit PBS auf 3 ng/μl. 100 μl des verdünnten Pertussis-Toxins werden mit einer 27-g-Nadel in eine 1-ml-Luer-Lock-Injektionsspritze überführt.
>3. Immunisierung der Lewis-Ratten
- Mischen Sie die Emulsion an Tag 0 einige Male. Verteilen Sie 200 μl der Emulsion, die 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin in vollständigem Freund-Adjuvans enthält, in 1-ml-Luer-Lock-Spritzen mit 27G-Nadeln. Injizieren Sie die Emulsion subkutan an der Basis der Rattenschwänze ohne Betäubung.
Anmerkung: Der Schwanz muss vor der Injektion nicht vorgewärmt werden. Jede Ratte wird mit 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin in vollständigem Freund-Adjuvans mit 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra immunisiert.
- An Tag 14 injizieren Sie 200 μl der Emulsion, die 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin enthält, in unvollständiges Freund-Adjuvans auf die gleiche Weise wie am Tag 0. Injizieren Sie am selben Tag 300 ng Pertussistoxin in 100 μl PBS intraperitoneal pro Ratte.
>4. Injektion des Antigengemisches in die Forniceal-Subkonjunktiva und die Tränenzelldrüse, um antigenspezifische Immunzellen zu rekrutieren und lokale Entzündungen zu verursachen
- Berechnen Sie die Menge an Ovalbumin und Tränendrüsenextrakt basierend auf der Anzahl der Ratten im Experiment. Wiegen Sie die erforderliche Menge Ovalbumin und kombinieren Sie es mit dem in Schritt 1 hergestellten aufgetauten Tränendrüsenextrakt, um eine Antigenlösung herzustellen, die 1 mg/ml Ovalbumin und 1 mg/ml Tränendrüsenextrakt enthält.
- Betäuben Sie die Ratten mit Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Kneifen Sie die Zehen von Ratten, um sicherzustellen, dass eine ordnungsgemäße Anästhesie erreicht wurde (d. h. nach dem Kneifen wird keine reaktionsschnelle Bewegung beobachtet). Injizieren Sie 5 μl Antigen in die Forniceal-Subkonjunktiva des Auges. Injizieren Sie 20 μl Antigen in die Tränendrüse.
