Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Seeding von Peritonealzellen in Kanalschnitten
- Nachdem Sie die peritoneale Mausmakrophagen-Zellsuspension auf und ab pipettiert haben, um die Verklumpung zu reduzieren, pipettieren Sie 100 μL Suspension in den vorgefüllten Kanal (Volumen, 100 μl) eines mit Fibronektin beschichteten Kanalobjektträgers (ein 100 μl Kanal hat die Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Füllen Sie die Kammer vor, indem Sie 1 ml mit Serum supplementiertes Medium RPMI 1640 (Hepes) in eines der beiden Reservoire des Kanalschiebers geben, den Objektträger kippen und dann das Medium aus dem nachgeschalteten Reservoir ansaugen (Abbildung 1).
- Entfernen Sie unerwünschte Luftblasen oder lange Luftstreifen im Kanal, indem Sie 1-2 mL Medium in einen der beiden Behälter geben, einen Behälterdeckel fest anbringen und dann die Luft durch rhythmischen Daumendruck auf den Deckel abpumpen und, falls erforderlich, den Schieber kippen. Kippen Sie nach dem Ausstoßen der Luft den Schieber mit dem unverschlossenen Behälter (und dem Medium) nach unten, bevor Sie die Kappe entfernen, um zu verhindern, dass Luft zurück in den Kanal gesaugt wird.
- Der mit Zellen besiedelte Objektträger wird in einer feuchten Kammer 2 h lang bei 37 °C in Abwesenheit von CO2 inkubiert (CO2 ist nicht erforderlich, da das HCO3-/CO2 -Puffersystem durch Hepes ersetzt wird). Die Kanalschlitten können bequem auf einem Gestell platziert werden, das acht Schienen fasst. In der Regel werden 6 bis 8 Folien mit einer Maus vorbereitet, obwohl bis zu 10 oder mehr möglich sind.
- Entfernen Sie das Gestell und tauschen Sie das Medium RPMI 1640 (Hepes) in jedem Objektträger gegen das Medium RPMI 1640 aus, das Bicarbonat enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum sowie Penicillin/Streptomycin.
- Kippen Sie den Schieber und saugen Sie das Medium zuerst aus dem unteren Behälter und dann aus dem oberen Behälter an. Geben Sie anschließend 1 ml des neuen Mediums in eines der Reservoirs, kippen Sie den Schieber und saugen Sie das Medium aus dem stromabwärts gelegenen Reservoir an, nachdem es durch den Kanal geflossen ist.
- Füllen Sie nach diesem Waschschritt (Mediumwechsel) den Kanalschieber, indem Sie 1 ml Medium in eines der Reservoirs geben.
Anmerkung: Die Waschschritte mit Kanalobjektträgern sind sehr einfach und effektiv in Bezug auf den Lösungsaustausch und die Entfernung nicht anhaftender Zellen. Beachten Sie, dass das Medium RPMI 1640 (Bicarbonat) normalerweise über Nacht mit 5 % CO2 vorinkubiert wird, um ein thermisches und pH-Gleichgewicht zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Führen Sie am nächsten Tag Experimente durch.
>2. Isolierung menschlicher roter Blutkörperchen
- An Tag 2 (dem zweiten Versuchstag; nach der Inkubation der isolierten Peritonealmakrophagen über Nacht) entnehmen Sie 1–2 ml peripheres venöses Blut von einem gesunden Spender in ein heparinisiertes Röhrchen. 1 mL in ein 2,0 mL (Polypropylen) Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden geben, bei 300 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren (empirische Einstellung) und den Überstand (Plasma und Buffy Coat) entfernen.
- Aspirieren Sie vorsichtig 100 μl der sedimentierten roten Blutkörperchen und mischen Sie dieses Volumen 1:1 mit modifiziertem RPMI 1640 (Hepes)-Medium (siehe unten) in einem 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden. Beschriften Sie das Rohr mit "1:1".
Anmerkung: Das RPMI 1640 (Hepes)-Medium, das an Tag 2 (für Assays) nach der Isolierung von Zellen verwendet wird, enthält neben 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum Penicillin (100 Einheiten/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 1 mM N-(2-Mercaptopropionyl)glycin (zur Verringerung der Phototoxizität). Im Folgenden wird dieses Medium als "modifiziertes" RPMI 1640 (Hepes) Medium bezeichnet.
- Pipettieren Sie 4 μl der 1:1 verdünnten Suspension der roten Blutkörperchen in 2 ml modifiziertes RPMI 1640 (Hepes) Medium, vorpipettiert in ein 2,0 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (wiederholen Sie diesen Schritt, d. h. bereiten Sie 2 Röhrchen vor). Beschriften Sie jedes Rohr mit "4:2000". Legen Sie die Röhren "1:1" und "4:2000" auf Eis.
>3. Markierung der Makrophagen-Plasmamembran
- Entnehmen Sie die ausgesäten Objektträger aus dem CO2 -Inkubator und tauschen Sie das Medium RPMI 1640 (Bicarbonat) in jedem Objektträger gegen ein modifiziertes Medium RPMI 1640 (Hepes) aus. Stellen Sie die Zellen anschließend in eine feuchte Kammer bei 37 °C in Abwesenheit von CO2,
Anmerkung: Nach der Inkubation und dem Waschen über Nacht werden die meisten Lymphozyten aus dem Kanal entfernt. Der Großteil der verbleibenden adhärenten Zellen sind Makrophagen, die entweder morphologisch oder durch Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-F4/80-Antikörpern identifiziert werden können. Etwa 95 % der Maus-residenten Peritonealmakrophagen sind F4/80-positiv.
- Verdünnen Sie den fluoreszierend grün markierten Anti-Maus-Antikörper F4/80 (gelagert bei 4 °C) 1:40 in modifiziertem RPMI 1640 (Hepes)-Medium. Nehmen Sie einen Objektträger, kippen Sie ihn und pipettieren Sie (Tropfen für Tropfen) 100 μl des Antikörpergemisches in die Öffnung des 100-μl-Kanals des Objektträgers (siehe Abbildung 1). Aspirieren Sie ein Medium, das in das nachgeschaltete Reservoir fließt. Inkubieren Sie die Zellen 20 min lang bei 37 °C (befeuchtete Umgebung, ohne CO2). Während der Inkubationszeit sind die roten Blutkörperchen des Menschen zu markieren (siehe Abschnitt 5).
Anmerkung: Wie oben angedeutet, ist CO2 nicht erforderlich, da das HCO3-/CO2 -Puffersystem durch Hepes ersetzt wird.
- Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten (während der die menschlichen roten Blutkörperchen gefärbt und opsonisiert werden) waschen Sie den Objektträger, indem Sie 1 ml modifiziertes RPMI 1640 (Hepes) Medium in eines der Reservoire geben und das Medium nach dem Fließen durch den Kanal aspirieren, was durch Kippen des Objektträgers erleichtert wird. Fügen Sie 1 ml Medium für die kurzfristige Lagerung hinzu oder fahren Sie mit einem Experiment fort (d. h. Pipettieren von Partikeln (opsonisierte rote Blutkörperchen) und Abbildung der Phagozytose durch konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie im Zeitraffer).
>4. Markierung der Plasmamembran menschlicher roter Blutkörperchen
- Beginnen Sie mit der Markierung menschlicher roter Blutkörperchen unmittelbar nach der Inkubation eines Objektträgers von Makrophagen mit grün fluoreszenzmarkiertem Anti-F4/80-Antikörper (nach Abschnitt 3.2). Nach schonendem Mischen werden 400 μL aus einem der "4:2000"-Röhrchen (siehe Abschnitt 2.3) entnommen und in ein 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen (runder Boden) abgegeben. Lassen Sie die Suspension auf etwa 37 °C erwärmen (siehe Absatz unten). 0,4 μl orange/rot fluoreszierende Plasmamembranfärbung zugeben (Aliquots bei -20 °C gelagert), mischen und bei 37 ΰC 5 min.
inkubieren
Anmerkung: Ein beheizter Aluminiumblock, der in der Laminar-Flow-Haube platziert wird, ist nützlich, um den Wärmeverlust bei der Vorbereitung der Objektträger zu minimieren. Die Rohre können in die Bohrschächte des Heizblocks gelegt werden, und eine separate oder integrierte, beheizte Aluminiumplatte kann als Arbeitsraum dienen.
- Bereiten Sie nach der 5-minütigen Inkubationszeit den ersten Waschschritt vor, indem Sie 1600 μl modifiziertes RPMI 1640 (Hepes) Medium hinzufügen (zum Befüllen des 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchens).
- Das Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren (empirische Einstellung). Ein kompaktes rotes Kügelchen sollte an der Wand (d. h. außermittig) am Boden des Rohrs sichtbar sein. Drehen Sie das Röhrchen so, dass das Pellet nach oben zeigt, und entfernen Sie vorsichtig nacheinander (in zwei Schritten) den gesamten Überstand mit einer Pipettenspitze von 1–1,5 ml.
- Nach dem Aspirieren des Überstands werden 2.000 μl modifiziertes RPMI 1640 (Hepes) Medium zugegeben, gemischt (um die Zellen zu resuspendieren) und die obigen Schritte der Zentrifugation und der Überstandsaspiration wiederholen.
- Resuspendieren Sie das Pellet (aus Plasmamembran gefärbten und 2x gewaschenen roten Blutkörperchen) mit 400 μl modifiziertem RPMI 1640 (Hepes) Medium. Beschriften Sie das Röhrchen mit PMS (Abkürzung für Plasmamembran-Färbung).
Anmerkung: Alternativ könnte der Succinimidylester eines pH-empfindlichen Rhodaminderivats, der bei saurem pH-Wert stärker fluoresziert, zur Markierung menschlicher roter Blutkörperchen verwendet werden. In diesem Fall dient die Fluoreszenzintensität zusätzlich als Maß für die Phagosomenreifung nach der Internalisierung von Partikeln.
>5. Opsonisierung (Markierung) von menschlichen roten Blutkörperchen mit Maus-Immunglobulin G (IgG)
- 1 μl monoklonaler (Klon HIR2) Anti-humaner CD235a-Antikörper (1 mg/ml) der Maus (IgG2b) (gelagert bei -20 °C) in das mit PMS markierte Röhrchen (siehe Abschnitte 4.2–4.5) geben, das Plasmamembran-gefärbte menschliche rote Blutkörperchen enthält, die in 400 μl Medium suspendiert sind. CD235a (auch bekannt als Glykophorin A) ist ein erythroides Membran-Sialoglycoprotein.
- Inkubieren Sie 8 Minuten lang bei 37 °C. Beachten Sie, dass die Opsonisierung menschlicher roter Blutkörperchen mit IgG zu einer Agglutination (Zellverklumpung) führt. Obwohl die Agglutination als visueller Indikator für die Opsonisierung dienen kann, ist sie für die Abbildung einzelner phagozytärer Effekte unerwünscht. Um eine Agglutination zu vermeiden, mischen Sie die Zellsuspension wiederholt (alle 1 min), z. B. mit einer Pipette mit variablem Volumen von 20–200 μl, die auf 200 μl eingestellt ist.
- Gegen Ende der 8-minütigen Inkubationszeit waschen Sie, falls gewünscht, den Makrophagen-Objektträger, der mit grün fluoreszenzmarkiertem Anti-F4/80-Antikörper inkubiert wurde, mit 1 mL modifiziertem RPMI 1640 (Hepes)-Medium. Stellen Sie sicher, dass beide Behälter des Rinnenschiebers nach den Waschschritten frei vom Medium sind.
>6. Bildgebung der Phagozytose von Plasmamembran-gefärbten und IgG-beschichteten menschlichen roten Blutkörperchen
- Nach der 8-minütigen Inkubation mit einem Anti-CD235a-Antikörper (Abschnitt 5.2) pipettieren Sie eine 100-μl-Suspension mit plasmamembrangefärbten und IgG-opsonisierten menschlichen roten Blutkörperchen in den Kanal eines Objektträgers, der Makrophagen enthält, die mit grün fluoreszierendem Anti-F4/80-Antikörper markiert sind (Schritt 3). So werden rot fluoreszierende, IgG-opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen zu grün fluoreszierenden Phagozyten (Makrophagen) hinzugefügt.
- Sobald menschliche rote Blutkörperchen hinzugefügt wurden, montieren Sie den Schienenträger auf ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop (mit einem auf 37 °C eingestellten Tischinkubator) für die Bildgebung, z. B. über eine 60X/1,49-Ölimmersionsobjektive. Beginnen Sie so schnell wie möglich mit der Bildgebung, da sich die Partikel innerhalb von 1 Minute abzusetzen beginnen
Anmerkung: Mit fluoreszierenden Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm haben wir durch Analyse von Punktspreizungsfunktionen XY-Auflösungen von x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (488 nm Laser) und x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (561 nm Laser) gemessen. Um jedoch Photobleaching und Phototoxizität bei der 3D-Bildgebung lebender Zellen im Zeitraffer zu reduzieren, kompromittieren wir die räumliche Auflösung mit 2 x 2 Binning. Binning erhöht die Empfindlichkeit (verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis) und die zulässige Bildrate, jedoch auf Kosten der räumlichen Auflösung.
- Verwenden Sie ein perfektes Fokussystem (oder ein ähnliches), um Fokusdrift während der Aufnahmen zu vermeiden. Nachdem Sie das perfekte Fokussystem aktiviert haben, verwenden Sie den Offset-Regler, um auf Makrophagen-Lamelipodien-Vorsprünge unmittelbar über dem Deckglas (siehe Hinweis unten) des Kanalschlittens zu fokussieren. Dieser Fokuspegel entspricht Z = 0 μm. Erhalten Sie Z-Stapel von -1 μm bis +16 μm in 0,8 μm-Schritten, was 22 Z-Schichten entspricht. Z-Stacks können z.B. mit einer Rate von 1 Stack (für jeden Kanal) alle 15 s erhalten werden, also insgesamt 16 min.
Anmerkung: Längere Aufnahmezeiträume leiden unter Einbußen an Bildqualität, vor allem durch Photobleaching. Für jeden der beiden Kanäle werden Z-Stacks erfasst: Makrophagen werden mit einem 488-nm-Laser (grüner Kanal) und menschliche rote Blutkörperchen mit einem 561-nm-Laser (roter Kanal) abgebildet. Mit diesem Ansatz können verschiedene Ansichten von Makrophagen gewonnen werden, die IgG-opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufnehmen (siehe z.B. Abbildung 2).
Anmerkung: Typische Einstellungen des Systems (mit 2 x 2 Binning) sind: Grünkanal (20,5 % Laserleistung (50 mW; 488 nm), 101 Empfindlichkeit (Bereich, 0–255) und 200 ms Belichtungszeit); Rotkanal (10,5 % Laserleistung (50 mW; 561 nm), 101 % Empfindlichkeit (Bereich, 0-255) und 98 ms Belichtungszeit).
Anmerkung: Die Unterseite des Schienenträgers besteht aus einem Polymer mit der gleichen Dicke wie ein Glasdeckglas #1,5 und den gleichen optischen Eigenschaften wie Glas, aber das Material hat vor allem den Vorteil der Gasdurchlässigkeit.
