Calcein-Acetoxymethyl-Färbung zur Bewertung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität gegenüber Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Chava, S. et al., Messung der durch natürliche Killerzellen vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von Lebertumorzellen. J. vis. exp. (2020)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung der Zytotoxizität von natürlichen Killerzellen gegen Krebszellen mit dem Calcein AM Farbstoff. Die reduzierte Anzahl fluoreszierender Krebszellen nach Co-Kultur mit natürlichen Killerzellen deutet auf eine natürliche Killerzell-vermittelte Zytotoxizität gegenüber Krebszellen hin.

Protokoll

>1. Calcein AM Färbebasierte mikroskopische Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität

1. Kultivieren Sie SK-HEP-1-Zellen mit einer Konfluenz von 70–80 %. Erzeugen Sie eine einzellige Suspension, indem Sie zuerst Zellen mit 5 mL 1x PBS waschen, gefolgt von einer Inkubation mit 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA.
2. Zentrifugieren Sie SK-HEP-1-Zellen in einem sterilen 1-ml-Zentrifugenröhrchen bei 160 x g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 mL serumfreiem DMEM.
3. Geben Sie 1,5 μl Calcein AM-Lösung (10 mM) in SK-HEP-1-Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie Calcein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL 1x PBS, um überschüssigen Calcein AM-Farbstoff zu entfernen.
5. Parallel dazu zentrifugieren Sie NK92MI-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem sterilen 15-mL-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie das Zellpellet einmal mit 5 mL 1x PBS und resuspendieren Sie es in 5 mL NK92MI Zellmedium.
6. Zählen Sie Calcein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen und NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
7. Resuspendieren Sie SK-HEP-1-Zellen im Kulturmedium bei 1 x 10⁵ Zellen/ml und NK92MI-Zellen bei 1 x 10⁶ Zellen/ml im NK-Zellmedium.
8. Platte Calcein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen (Zielzellen) (1 x 10⁴/100 μL/Well) mit NK92MI-Zellen (Effektorzellen) (1 x 10⁵/100 μL/Well) (1:10 Ziel: Effektorverhältnis) pro Well in dreifachen Wells in einer 96-Well-Platte.
9. Die 96-Well-Platten werden bei 37 °C in einer Atmosphäre von 95 % Luft und 5 % CO₂ 4 h lang inkubiert. Nach der Inkubation nehmen Sie Fluoreszenzbilder der Calcein AM-markierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung auf. Erfassen Sie mindestens 10 verschiedene Felder jedes Replikats für jeden Behandlungszustand.
10. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Bilder für jedes Replikat aus und zählen Sie Calcein AM-positiv markierte Zielzellen, die mit oder ohne NK92MI-Zellen inkubiert wurden. Berechnen Sie % Zytotoxizität mit der folgenden Formel.
    
    Anmerkung: Als Kontrollen sind Zielzellen ohne NK92MI-Zellen und vollständig lysierte Zielzellen als vollständige Lysekontrolle zu verwenden. Für eine vollständige Lyse inkubieren Sie die Zellen 1 h lang in 0,5 % Triton X-100 (20 μl von 5 % Triton X-100 in 200 μl Kulturmedium).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Farbstoff Calcein AM	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 17783
DMEM	Gibco	Nr. 11965-092
Fötales Rinderserum	Gibco	26140079
Pferde-Serum	Gibco	16050114
NK92MI-Zellen	ATCC	CRL-2408
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	Nr. P4417
SKHEP-1 Zellen	ATCC	HTB-52
Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco	25200056