Messung der Migration natürlicher Killerzellen als Reaktion auf chemotaktische Reize

Zusammenfassung

Quelle: Chava, S., et al. Messung der durch natürliche Killerzellen vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von Lebertumorzellen. J. vis. exp. (2020).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Untersuchung der Migration von natürlichen Killerzellen (NK) durch ein poröses Membraneinsatzsystem als Reaktion auf Chemoattraktivstoffe. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse der NK-Zellmigration mittels Durchflusszytometrie.

Protokoll

>1. NK-Zellmigrations-Assay

1. Züchten Sie NK92MI-Zellen und Zentrifugenzellen in einer Menge von 160 x g für 3 Minuten in einem sterilen 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
2. Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 5 mL 1x PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 3 mL serumfreiem NK92MI Zellmedium. Zählen Sie NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
3. Platte NK92MI-Zellen (2,5 x 10⁵ Zellen/100 μl/Well) im oberen Fach der transwell-permeablen Kammer (Einsatz mit 6,5 mm Durchmesser und Porengröße von 5 μm).
4. In die untere Kammer werden 0,6 ml serumfreies Medium gegeben, das Material enthält, das auf die Eigenschaften von NK-Zellen als Chemoattraktivstoff getestet werden soll (z. B. konditioniertes Medium, Chemokine, Zytokine).
   Anmerkung: Verwenden Sie bei der Herstellung von konditioniertem Medium ein serumreduziertes Medium ohne Zusatz von Serum, um Interferenzen durch Serumproteine im Migrationsassay zu vermeiden.
5. Inkubieren Sie die 24-Well-permeablen Kammern bei 37 °C für 4 h. Nach 4 Stunden werden die nicht adhärenten und migrierten NK92MI-Zellen aus der unteren Kammer entnommen und zur weiteren Analyse in Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierröhrchen (FACS) überführt.
   Anmerkung: Die Zeit der Kultivierung kann je nach Art der Zielzellen sowie der Menge und Kinetik der von den Zielzellen produzierten Chemokine variieren. Daher sollte dieser Zeitpunkt für jeden Zelltyp, jedes Chemokin und jedes Experiment empirisch bestimmt werden.
6. Geben Sie eine vorgegebene Anzahl von Zählkügelchen für die Durchflusszytometrie in einem Volumen von 50 μl in jedes Röhrchen mit migrierten NK-Zellen. Bestimmen Sie das Volumen von 300 μl/Well-Zellsuspension mit einem Durchflusszytometer, das eine automatisierte FACS-basierte Zellzählung ermöglicht.
   Anmerkung: Mischen oder wirbeln Sie die Zählkügelchen für die Durchflusszytometrie jedes Mal gründlich durch, um sicherzustellen, dass eine konstante Anzahl von Kügelchen verwendet wird, um die experimentelle Variabilität zu minimieren. Rückwärtspipettieren wird mit Zählperlen empfohlen, um die Genauigkeit zu erhalten. Verwenden Sie nur NK-Zellen und Zählbeads für die Durchflusszytometrie als FACS-Analysekontrollen. Die Autoren empfehlen, mindestens 10.000 Kügelchen + NK-Zellen zusammen zu lesen, eine Menge, die gut funktioniert hat. Diese Zahl kann jedoch je nach Versuchsbedingungen variieren. Daher sollte die kombinierte Anzahl von Kügelchen + NK-Zellen für jede Art von Experiment empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, Experimente mit biologischen Triplikaten durchzuführen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen und die Variabilität zwischen verschiedenen Zellzahlen zu berücksichtigen.
7. Berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK92MI-Zellen mit dieser Formel:
   
   wobei A = Anzahl der Zellen, B = Anzahl der Kügelchen, C = zugewiesene Kügelchenzahl der Charge (Anzahl der Zählkügelchen für die Durchflusszytometrie/50 μL; in diesem Beispiel 49.500) und D = Probenvolumen (μL)
   Anmerkung: Werden 300 μl Probenvolumen (migrierte Zellen) für die FACS-Analyse mit 50 μl Zählkügelchen für die Durchflusszytometrie verwendet, so ergibt sich die absolute Anzahl der migrierten Zellen = 1.700 Zellen /3.300 Kügelchenereignisse x 49.500 Kügelchen/300 μl = 84,975 Zellen/μl. Die Berechnung sollte korrigiert werden, wenn die Probe verdünnt wird oder wenn ein anderes Volumen von FACS-Zählperlen verwendet wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Absolute Zählperlen	Thermo Fisher Scientific	Nr. C36950
NK92MI-Zellen	ATCC	CRL-2408
SKHEP-1 Zellen	ATCC	HTB-52
Transwell-durchlässige Kammern	Costar	3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	Nr. P4417
Alpha-MEM	Sigma-Aldrich	Nr. M4256

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