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>1. Komplement- und Zielbakterien vorbereiten
- Präparat für Kaninchenbabys (BRC)
HINWEIS: Detaillierte Kriterien für die Auswahl von Komplementlos finden Sie hier: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Holen Sie sich gefrorenes BRC und tauen Sie es mit fließendem kaltem Wasser auf. Mischen Sie das BRC alle ~10-20 Minuten, bis es vollständig aufgetaut ist. Setzen Sie BRC keinen wiederholten Frost-Tau-Zyklen aus.
- Während BRC auftaut, beschriften Sie 1,5 ml, 5 mL oder 15 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie die beschrifteten Röhrchen zum Vorkühlen auf Eis. Aliquotieren Sie das richtige Volumen BRC in die vorgekühlten Zentrifugenröhrchen (nach dem Befüllen jedes Röhrchen sofort wieder auf das Eis legen). Aliquots bei ≤ -70 °C im Gefrierschrank lagern.
Anmerkung: Für jede Assay-Platte wird ca. 1 ml Komplement benötigt. Komplementaliquote sind für den einmaligen Gebrauch bestimmt und sollten in Volumina aliquotiert werden, die für die Assay-Layouts geeignet sind.
- Um hitzeinaktiviertes BRC herzustellen, tauen Sie ein Aliquot des aktiven BRC auf. Bereiten Sie ein 56 °C warmes Wasserbad vor. Nachdem BRC vollständig aufgetaut ist, geben Sie es in das Wasserbad und inkubieren Sie es 30 Minuten lang.
- Nach der Inkubation hitzeinaktiviertes BRC aus dem Wasserbad nehmen und 10-15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Kräftig mischen und ~150 μl auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren. Aliquots bei ≤ -10 °C lagern.
- Bereiten Sie die Zielbakterienbrühe vor
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird verwendet, um 48 Aliquots des Zielbakterienbestands herzustellen; Wenn mehr Aliquots benötigt werden, kann das Protokoll skaliert werden.
- Nehmen Sie das Fläschchen mit dem Bakterienvorrat aus dem Gefrierschrank und kratzen Sie die gefrorene Bakterienoberfläche ab, um eine kleine Menge Eis aus dem Fläschchen auf eine Blutagarplatte zu entfernen. Stellen Sie das Hauptvorratsfläschchen sofort wieder in den Gefrierschrank.
- Streichen Sie dieses kleine Aliquot des Bakterienbestands auf die Blutagarplatte und decken Sie sie mit dem Plattendeckel ab. Inkubieren Sie die Platte über Nacht kopfüber in einem 37 °C/5 % CO2 -Inkubator.
- Übertragen Sie ~10 isolierte glatte Kolonien in ein 50-ml-Röhrchen mit 30 mL LB-Brühe. 3-5 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubieren, bis die Kulturbrühe einen OD600 von ~0,6-0,7 hat.
- Ernten Sie die obersten 12,5 ml der Kultur und geben Sie sie in ein frisches 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Kultur 2 Minuten lang bei 15.000 x g mit einer Tisch-Mikrozentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml 15 % sterilem Glycerin-LB.
- Gut mischen und 0,5 mL Aliquots in sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (~48 Röhrchen) geben. Aliquots bei ≤ -70 °C im Gefrierschrank lagern.
- Bestätigen Sie vor der Anwendung die bakterielle Identität mit dem Agglutinationstest.
- Bestimmung des optimalen Verdünnungsfaktors für Zielbakterien stock
HINWEIS: Jede Charge des Zielbakterienbestands muss unter Assay-Bedingungen titriert werden, um die Verdünnung zu bestimmen, die erforderlich ist, um ~120 KBE/Spot auf LB-Platten zu erhalten.
- Besorgen Sie sich eine Mikrotiterplatte (Verdünnungsplatte) und geben Sie 135 μl Assay-Puffer in Vertiefung 1A. Geben Sie 120 μl Assay-Butter in die Vertiefungen 1B-1H.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Zielbakterien aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es bei Raumtemperatur auf. Geben Sie 15 μl aufgetaute Bakterienbrühe zu Vertiefung 1A, um eine 10-fache Verdünnung der Bakterienbrühe zu erreichen.
- Übertragen Sie 30 μl bakterielle Lösung von Vertiefung 1A in Vertiefung 1B, um eine 5-fache serielle Verdünnung durchzuführen. Fahren Sie mit 5-fachen seriellen Verdünnungen bis Bohrung 1H fort, um insgesamt 8 Verdünnungen zu erhalten (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- Besorgen Sie sich eine weitere Mikrotiterplatte (Assay Plate) und geben Sie 20 μl Assay Puffer in alle Wells in den Spalten 1 und 2 der Assay Plate.
- Übertragen Sie 10 μl verdünnte Bakterien aus jeder Vertiefung in Spalte 1 der Verdünnungsplatte in die entsprechenden Vertiefungen in den Spalten 1 und 2 der Assay-Platte. 10 μl Bakterien werden aus der Vertiefung 1A der Verdünnungsplatte in die Vertiefungen 1A und 2A in der Assay-Platte usw. übertragen.
- Fahren Sie mit dem Assay fort, wie im Serum Bactericidal Assay (SBA) unten für Kontrolle A und Kontrolle B, Schritte 3.6-3.12 beschrieben.
- Nachdem die Platten auf Eis inkubiert wurden, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette mit 8 Pipettenspitzen, um 10 μl aus den Vertiefungen in Spalte 1 auf eine LBA-Platte zu sprühen. Markieren Sie auch die Vertiefungen aus Spalte 2 auf der LBA-Platte.
- Fahren Sie mit dem Assay fort, wie unten in den Schritten 3.14-4.6 beschrieben.
- Bestimmen Sie die Bakterienverdünnung, die ~120 KBE/Spot in Kontrolle B ergibt, diese Verdünnung wird im Assay verwendet.
>2. Bakterizider Serum-Assay (SBA)
HINWEIS: Das unten beschriebene Verfahren gilt für eine Assay-Platte, aber die Anzahl der Assay-Platten kann erhöht werden.
- Hitzeinaktivierung der Proben durch Inkubation der Proben in einem 56 °C heißen Wasserbad für 30 min.
Anmerkung: Die Prüfmuster müssen vor der Prüfung hitzeinaktiviert werden, um jegliche endogene Komplementaktivität aufzuheben. Dies kann vor dem Assay erfolgen, und inaktivierte Proben können wieder eingefroren oder bis zum Test bei 4 °C gelagert werden.
- Holen Sie sich eine Assay-Platte und fügen Sie 20 μl Assay-Puffer zu den Spalten 1 bis 12 der Zeilen A bis G hinzu. Geben Sie 20 μl Assay-Puffer zu den Spalten 1 und 2 von Zeile H, siehe Tabelle 1.
- Laden Sie 30 μl jeder Testprobe in doppelter Ausführung in Reihe H der Assay-Platte. Dispensieren Sie z. B. 30 μl der Probe 1 in die Vertiefungen 3H und 4H und 30 μl der Probe 2 in die Vertiefungen 5H und 6H usw.
- Führen Sie 3-fache Serienverdünnungen von Testproben mit einer Mehrkanalpipette durch.
- Entnehmen Sie 10 μ der Probe aus den Vertiefungen 3H-12H und überführen Sie sie in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe G und mischen Sie die Probenvertiefung, indem Sie 8-10 Mal auf und ab pipettieren.
- Dann 10 μ aus den Vertiefungen 3G-12G entfernen und in die entsprechenden Vertiefungen in Reihe F umfüllen und gut vermischen.
- Fahren Sie mit diesen seriellen Verdünnungen durch Reihe A fort. Nach dem Mischen der Vertiefungen in Reihe A werden 10 μl aus den Vertiefungen 3A-12A entnommen und verworfen, so dass alle Vertiefungen 20 μl enthalten.
Anmerkung: Da 20 μl Serum in einem Gesamt-Assay-Volumen von 80 μl verwendet werden, ergibt sich eine 4-fache zusätzliche Verdünnung im Assay. Diese Verdünnung muss bei der Berechnung eines SBA-Titers berücksichtigt werden, indem die Serumverdünnung mit 4 multipliziert wird. Wenn beispielsweise eine Anfangsverdünnung von 1:2 verwendet wird, beträgt die tatsächlich zu testende Verdünnung 1:8.
- Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit gefrorener Zielbakterienbrühe heraus und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Verdünnen Sie die Bakterien in 20 ml Assay-Puffer gemäß dem vorbestimmten optimalen Verdünnungsfaktor (dieser Verdünnungsfaktor wurde in Abschnitt 1.3 bestimmt). Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 10 μl verdünnte Bakterien in jede Vertiefung der Assay-Platte.
- Nehmen Sie ein Fläschchen mit gefrorenem BRC und ein Fläschchen mit gefrorenem hitzeinaktiviertem BRC, tauen Sie es bei Raumtemperatur mit fließendem kaltem Wasser auf oder stellen Sie es auf den Rost einer biologischen Sicherheitswerkbank mit Blasluft, um schnell aufzutauen.
- Bereiten Sie eine 20%ige Lösung aus hitzeinaktiviertem BRC vor. Mischen Sie 100 μl hitzeinaktiviertes BRC mit 400 μl Assay-Puffer. Geben Sie 50 μl dieser 20%igen hitzeinaktivierten BRC-Lösung in alle Vertiefungen in Spalte 1 (Vertiefungen von Kontrolle A).
Anmerkung: Hitzeinaktiviertes BRC wird als Kontrolle zur Überwachung der unspezifischen Abtötung (NSK) im Assay verwendet.
- Bereiten Sie eine 20%ige Lösung von nativem BRC vor. Mischen Sie 1 ml natives BRC mit 4 ml Assay-Puffer. Geben Sie 50 μl dieser Mischung in alle Vertiefungen in den Spalten 2 bis 12 (Kontrolle B und Testprobenvertiefungen).
Anmerkung: Die Endkonzentration von BRC im Reaktionsgemisch beträgt 12,5 %.
- Mischen Sie die Assay-Platte kurz, indem Sie sie 10-15 s lang leicht auf einem Plattenschüttler schütteln, oder mischen Sie, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 8 Mal auf und ab pipettieren.
- Legen Sie die Assay-Platte für 2 h (ohne Schütteln) in einen mikrobiologischen Inkubator bei 37 °C.
- Trocknen Sie 2 LBA-Platten, indem Sie die Deckel abnehmen und die Platten mit der Vorderseite nach oben für 40-60 Minuten in die biologische Sicherheitswerkbank legen.
- Wenn die 2-stündige Inkubation abgeschlossen ist, stellen Sie die Assay-Platte auf nasses Eis und inkubieren Sie sie 10-20 Minuten lang, um die Reaktion zu stoppen.
- Mischen Sie mit einer 12-Kanal-Pipette die Wells in Reihe H und geben Sie 10 μl des Reaktionsgemisches auf den Boden einer LBA-Platte. Kippen Sie die Platte sofort und lassen Sie die Spots ~1,5-2 cm laufen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Reihen G, F und E, und markieren Sie sie über der vorherigen Reihe auf der LBA-Platte. Die Reihen E, F, G und H sind auf einer LBA-Platte und die Reihen A, B, C und D auf einer zweiten LBA-Platte auf die gleiche Weise gefleckt, siehe Abbildung 1.
- Inkubieren Sie die LBA-Platten bei Raumtemperatur, bis die Lösung in die LBA-Platten adsorbiert ist (10-15 min). Setzen Sie die Deckel auf die LBA-Platten und legen Sie die LBA-Platten kopfüber in den mikrobiologischen Inkubator, um sie über Nacht (~16-18 h) zu inkubieren. Shigella flexneri 2a und 3a bei 29 °C und S. sonnei bei 26 °C inkubieren.
Anmerkung: Diese Temperaturen ergeben kleinere "Mikrokolonien" mit Größen, die für eine genaue Zählung mit einem Koloniezähler geeignet sind9.
- Nach der Inkubation über Nacht geben Sie 25 mL Overlay-Agar (bei ~55 °C) mit 100 μg/mL TTC und 0,1 % NaN3 zu jeder LBA-Platte.
- Die LBA-Platten werden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, damit die überlebenden Bakterien eine rote Farbe entwickeln können, siehe Abbildung 1 unten.
- Fotografieren Sie Platten mit einer Digitalkamera und übertragen Sie Bilder auf einen Computer, auf dem die Integrated Colony Enumerating Software (NICE) von NIST installiert wurde, siehe Abbildung 2.
Anmerkung: Die NICE-Koloniezählungssoftware ist kostenlos erhältlich. Weitere Informationen und Installationsanweisungen finden Sie in der Materialliste.
Tabelle 1: Layout der Assay-Platte. Die Spalten 1 und 2 enthalten die Komplementkontroll-Wells. Kontrolle A befindet sich in Spalte 1 und ist die hitzeinaktivierte Komplementkontrolle, die SBA-Puffer, Bakterien und hitzeinaktiviertes Komplement enthält. Kontrolle B befindet sich in Spalte 2 und ist die aktive Komplementkontrolle, die SBA-Puffer, Bakterien und Komplement enthält. Die Spalten 3-12 enthalten Serumproben. Jede Probe wird in doppelter Ausführung durchgeführt und seriell 3-fach verdünnt von Reihe H nach Reihe A
| 1 | arabische Ziffer | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ein | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 | Verdünnung 8 |
| Vgl. | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 | Verdünnung 7 |
| C | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 | Verdünnung 6 |
| D | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 | Verdünnung 5 |
| E | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 | Verdünnung 4 |
| F | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 | Verdünnung 3 |
| G | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 | Verdünnung 2 |
| H | Steuerung A | Steuerung B | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 | Verdünnung 1 |
| | | Beispiel 1 | Beispiel 2 | Beispiel 3 | Beispiel 4 | Beispiel 5 |
