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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von CFSE-markierten apoptotischen Thymozyten
- Zwei naive C57/B6-Mäuse werden 10 Minuten lang durch CO2 -Inhalation eingeschläfert und präpariert, um die Brusthöhle zu öffnen, der Thymus mit einer gebogenen Pinzette mit feiner Spitze entfernt (herausgezogen) in eine Gewebskultur-Petrischale mit 10 ml RPMI1640 Medium.
- Erhalten Sie eine einzellige Suspension, indem Sie den gesamten Thymus gegen zwei mattierte Enden der Objektträger mahlen und dann die Suspension durch ein 100-μm-Zellsieb filtrieren.
- Sammeln Sie die 10 mL Thymussuspension in einem 50 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie in 40 ml 1x PBS und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie in 20 mL 1x PBS in einem 50 mL Röhrchen als Einzelzellsuspension mit bis zu 2 x 108 Zellen (wenn mehr als 2 x 108 Zellen, resuspendieren Sie den Rest der Zellen in weiteren 20 mL von 1 x PBS in einem anderen 50 mL Röhrchen).
- Stellen Sie 5 μM CFSE in gleichem Volumen (20 ml) von 1x PBS in einem separaten 50 ml-Röhrchen her, indem Sie 40 μl CFSE-Stammlösung (2,5 mM) in 20 mL 1x PBS pipettieren und gut mischen, indem Sie das Röhrchen 2 - 3 Mal umdrehen.
- Fügen Sie die 20 mL CFSE aus Schritt 1.7 zu den 20 mL Zellsuspension aus Schritt 1.6 hinzu (die Endkonzentration von CFSE beträgt jetzt 2,5 μM).
Anmerkung: Für jede 20-ml-Zellsuspension wird ein 20-ml-CFSE-Schlauch benötigt.
- Drehen Sie die Zelle und das CFSE-Gemischröhrchen 2 - 3 Mal um und inkubieren Sie das Gemisch im Dunkeln bei Raumtemperatur für maximal 2 Minuten, dann stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 mL hitzeinaktiviertem Pferdeserum.
- Die 50 mL Röhrchenmischung bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Anmerkung: Wenn die CFSE-Markierung erfolgreich ist, wird das Zellpellet hellgelb.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 40 ml 1x PBS und zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.
- Die Zellsuspension wird bei 300 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Waschen Sie das Zellpellet erneut mit 40 mL RPMI1640 Medium.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit RPMI1640 Gewebekulturmedium (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10 % FBS (hitzeinaktiviert), 20 mM Glutamin und 1x Pen/Strepto) in einer Konzentration von 7 x 106 Zellen/ml in einer 100 mm Gewebekulturschale.
Anmerkung: Wenn mehr Zellen gewonnen werden, wird eine separate 100-mm-Gewebekulturschale benötigt.
- Geben Sie Staurosporin in die Zellsuspensionskultur in einer Endkonzentration von 1 μM und kultivieren Sie es 4 h lang bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator, der mit 5 % CO2 versorgt wird.
>2. Präparation von Peritonealmakrophagen
- Injizieren Sie zwei C57B6-Mäuse (oder genmanipulierte Mäuse im Labor) intraperitoneal mit 1 ml 3% gealtertem Thioglycollat an Tag 0.
- Euthanasieren Sie die Mäuse an Tag 5 wie in Schritt 1.1, schneiden Sie die Bauchhaut auf und schälen Sie sie, aber lassen Sie das Bauchfell intakt. Spülen Sie die Bauchhöhle, indem Sie mit einer 10-ml-Spritze, die an einer 18-G-Nadel befestigt ist, schnell 10 ml Waschpuffer (RPMI1640, 2 % FBS, 0,04 % EDTA) in die Bauchhöhle drücken.
- Entnehmen Sie den Waschpuffer langsam mit derselben Nadel/Spritze und sammeln Sie den Waschpuffer in einem 50-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Peritonealsonde zweimal mit 1x PBS, resuspendieren Sie die Peritonealmakrophagen in RPMI1640 Gewebekulturmedium mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen/ml und aliquotieren Sie 500 μl in jede Vertiefung der 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte 2 h in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Entfernen Sie die schwimmenden Zellen, indem Sie sie zweimal aspirieren und durch 500 μl frisches Kulturmedium ersetzen.
- Optional wird der TAM-Rezeptor-Tyrosin-Inhibitor RXDX-106 in den in den Abbildungslegenden angegebenen Konzentrationen in jede Vertiefung der Makrophagenkultur gegeben und weitere 2 Stunden inkubiert.
>3. Co-Kultur von peritonealen Makrophagen mit apoptotischen Thymozyten
- Apoptotische Thymozyten aus Schritt 1 sammeln und dreimal mit RPMI1640 Medium waschen. Die Effizienz der apoptotischen Induktion kann in diesem Stadium mit dem Annexin V/7-AAD-Kit gemessen werden.
- Verteilen Sie 0 - 12 x 106 Zellen (in 500 μL Medium) in jede Vertiefung der Makrophagenkulturen aus Protokoll #2, entsprechend der Versuchsanordnung (z.B. siehe Abbildung 1). Dies ergibt das gesamte Kulturvolumen von 1 mL in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte. Geben Sie den blockierenden Antikörper unmittelbar vor der Zugabe apoptotischer Thymozyten in die Kultur.
- Die Zellmischung wird bei 37 °C für 4 h in einem mit 5 % CO2 versorgten Gewebekultur-Inkubator kultiviert.
- Waschen Sie jede Vertiefung der Kultur zweimal mit 1x PBS (mit 500 μM EDTA), um die frei schwebenden apoptotischen Zellen zu entfernen.
- Färben Sie die plattengebundenen Makrophagen in diesem Stadium mit CD11b-PE.
- Waschen Sie die plattengebundenen Makrophagen einmal mit einem Färbepuffer (1x PBS, 1% BSA).
- Geben Sie 200 μl Färbepuffer mit 2 μl CD11b-PE in jede Vertiefung
.
- Die Platte bei 4 °C 20 min inkubieren.
- Waschen Sie jede Vertiefung der Platte dreimal mit dem Färbepuffer.
- Fügen Sie 200 μl Färbepuffer hinzu und fahren Sie mit der Platte für die Bildanalyse unter dem Fluoreszenzmikroskop fort.
