Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Serum-Kollektion
- Sammeln Sie Serumproben von Menschen zu interessanten Zeitpunkten. Für diese Studie sammelten wir Seren an den Tagen 0 (Zeitpunkt der Grippeimpfung), +7, +30, +60 und +180 nach der Impfung.
- Um das Serum zu erhalten, zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 1.200 x g für 10 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C).
Anmerkung: Nicht zentrifugierte Blutproben sollten bei 4 °C und nicht länger als 24 Stunden gelagert werden.
- Aliquotieren Sie das Serum in verschiedene Röhrchen (Kryo-Fläschchen) und frieren Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C ein.
- Führen Sie die nachfolgenden Assays chargenweise durch, einschließlich aller Zeitpunkte einer Person, um die Variabilität innerhalb eines Patienten zu reduzieren.
>2. Vorbereitung von Antigenen
VORSICHT: Es werden fünf verschiedene Antigene verwendet (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie Antigene in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) vor.
- Rekonstituieren Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers den Gesamtinhalt einer lyophilisierten Influenzaantigen-Ampulle mit 1,0 ml destilliertem Wasser und lassen Sie das gelöste Antigen mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, bevor Sie fortfahren.
- Die Antigenlösung wird in 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C eingefroren.
>3. Herstellung von Cholerafiltrat
HINWEIS: Cholerafiltrat wird gemäß dem Protokoll der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als rezeptorzerstörendes Enzym (RDE) verwendet. Dadurch werden angeborene Inhibitoren aus dem Serum entfernt, die den Assay beeinträchtigen würden.
- Rekonstituieren Sie das lyophilisierte RDE gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Lagern Sie die RDE-Lösung bis zur weiteren Verwendung in einem 15-ml-Röhrchen bei 4 °C.
>4. HA-Assay
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Hämagglutinationshemmungstests (HI) zwischen mehreren Platten vergleichbar sind, muss für jede Platte die gleiche Menge an Viruspartikeln verwendet werden. Der Hämagglutinationstest (HA) (auch HA-Titration genannt) wird durchgeführt, um die für die Hämagglutination erforderlichen Viruspartikel zu quantifizieren, und wird in HA-Einheiten aufgezeichnet. Eine "Einheit" der Hämagglutination ist eine operationelle Einheit, die von der für die HA-Titration verwendeten Methode abhängt und keine Messung einer absoluten Virusmenge darstellt. Daher ist eine HA-Einheit definiert als die Menge an Virus, die benötigt wird, um ein gleiches Volumen einer standardisierten RBC-Suspension zu agglutinieren. Nach Angaben der WHO beträgt die für den HI-Test verwendete Standardmenge 4 HA-Einheiten pro 25 μl. Eine Veranschaulichung des Prinzips des HA-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt.
HINWEIS: Die verwendeten roten Blutkörperchen (RBCs) hängen von der Art des Influenzavirus im Assay ab (Tabelle 1). Darüber hinaus unterscheiden sich bei verschiedenen Typen von 96-Well-Mikrotiterplatten sowohl die Inkubationszeit als auch das Aussehen der nicht agglutinierten Zellen (Tabelle 2).
- Vorbereitung der RBC-Suspension
- Die Erythrozyten-Stammsuspension (10 %, v/v; außer menschlicher Typ O) (siehe Materialtabelle) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen, um die für Avisal- und Säugetier-Erythrozyten geeigneten Konzentrationen von 0,75 % bzw. 1 % zu erreichen.
- Vorbereitung der 96-Well-Mikrotiterplatte
HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie einen Überblick über die Plattenkonstruktion.
- Geben Sie 25 μl PBS mit einer Mehrkanalpipette in die Vertiefungen 1 bis 12 jeder verwendeten Reihe einer 96-Well-Mikrotiterplatte (Abbildung 2). Verwenden Sie die V-förmige Mikrotiterplatte, wenn Sie mit aviären Erythrozyten wie Huhn und Pute arbeiten. Verwenden Sie die U-förmige Mikrotiterplatte, wenn Sie mit Erythrozyten von Säugetieren wie Meerschweinchen und menschlichem Typ O arbeiten (Tabelle 2).
- Geben Sie 25 μl Influenza-Antigen in die erste Vertiefung der Antigenreihen, die in Duplikaten angeordnet sind. Den Kontrollreihen wird kein Antigen zugesetzt. Die Kontrollreihen sollten keinen Hämagglutinationseffekt aufweisen und als Negativkontrollen dienen (Abbildung 2).
- Führen Sie eine serielle 2-fache Verdünnung durch, indem Sie 25 μl aus der ersten Vertiefung der Antigenreihen mit einer Mehrkanalpipette in aufeinanderfolgende Vertiefungen übertragen. Mischen Sie jeden Verdünnungsschritt, indem Sie 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
- Entsorgen Sie die letzten 25 μl der letzten Vertiefungen.
- Geben Sie 25 μl PBS mit einer Mehrkanalpipette in die Vertiefungen 1 bis 12 jeder verwendeten Reihe, um ein Gesamtvolumen von 50 μl pro Vertiefung zu erreichen.
- Geben Sie 50 μl der Erythrozytensuspension mit einer Mehrkanalpipette in jede verwendete Vertiefung.
- Zum Mixen 10 Mal vorsichtig an allen vier Seiten auf den Teller klopfen.
- Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie je nach verwendeter Erythrozytenspezies so lange wie vorgesehen bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 2). Bewegen Sie die Platte während der Inkubation nicht.
- Ablesen der Platte
HINWEIS: Die Anzeige unterscheidet sich bei der Verwendung von aviären Erythrozyten geringfügig von der von Säugetieren, da die Mikrotitervertiefungen unterschiedlich geformt sind (Abbildung 3).
- Auslesung von aviären RBCs
- Kippen Sie die Platte um 90° für 25 s.
Anmerkung: Der Endpunkt der HA-Titration ist die letzte Vertiefung, in der eine vollständige Hämagglutination stattfindet. Diese Vertiefung enthält 1 HA-Einheit des Virus. Aufgrund der 2-fachen Verdünnungen des Antigens befindet sich zwei Vertiefungen vor dem Endpunkt der HA-Titration die Vertiefung, die 4 HA-Einheiten des Virus enthält (Abbildung 4).
- Markieren Sie die Ergebnisse sofort, während sich die Platte noch in einer gekippten Position befindet, auf einem gedruckten Schema der 96-Well-Platte. Die Agglutinationsmuster der aviären Erythrozyten sind in Abbildung 3 dargestellt.
- Auslesung von Erythrozyten bei Säugetieren
- Markieren Sie die Ergebnisse auf einem gedruckten Schema der 96-Well-Platte, ohne die Platte zu kippen (horizontale Position auf der Bank).
Anmerkung: Wenn die Hämagglutination auftritt, setzen sich die verklebten Zellen nicht am Boden ab, während nicht agglutinierte Zellen als Halo am Boden der Vertiefung erscheinen. Der Halo der teilweise verklebten Zellen ist weniger intensiv und hat einen größeren Durchmesser (Abbildung 3).
- Bestimmung von 4 HA-Einheiten.
Anmerkung: Das Kippen der Platte ist entscheidend für die Unterscheidung von Vogelmustern, da alle drei verschiedenen Arten von Agglutinationsmustern (vollständig agglutiniert, teilweise agglutiniert und nicht agglutiniert) als Knopf erscheinen, wenn sie nicht gekippt werden.
>5. HI-Assay
HINWEIS: Der Arbeitsablauf des Protokolls wurde optimiert, um eine effizientere Handhabung mehrerer Proben gleichzeitig zu ermöglichen, durch die Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Röhrchenstreifen und einem Thermocycler (siehe unten).
- Vorbereitung der Serumproben
Anmerkung: Bereiten Sie Serumproben in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) vor.
- Tauen Sie die gefrorenen Serumproben jedes Zeitpunkts jeder Person (siehe Schritt 1.2) bei Raumtemperatur auf.
- Geben Sie ein Aliquot von 10 μl jeder aufgetauten Serumprobe in ein Röhrchen PCR-Röhrchenstreifen (10 Röhrchen in einem Streifen).
Anmerkung: Der große Vorteil der Verwendung von PCR-Röhrchenstreifen besteht darin, dass eine Mehrkanalpipette für die folgenden Schritte im HI-Assay verwendet werden kann; Dies spart viel Zeit bei der Untersuchung einer großen Anzahl von Serumproben und bei der wiederholten Messung derselben Proben auf Antikörpertiter gegen verschiedene Virusstämme.
- Lagern Sie die aliquotierten Serumproben bis zur Verwendung in den PCR-Röhrchenstreifen bei -80 °C.
- Einen Tag vor der Durchführung des HI-Assays tauen Sie die Aliquots der Serumprobe bei Raumtemperatur auf.
- Geben Sie 10 μl des entsprechenden Anti-Serums in ein leeres PCR-Röhrchen.
Anmerkung: Um als Positivkontrolle zu dienen, muss das Anti-Serum gegen ein bestimmtes Virus mit dem verwendeten Virus übereinstimmen. Die Positivsteuerung ermöglicht die Standardisierung der Plattenleistung über mehrere Platten.
- Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 30 μl Cholerafiltratlösung zu jedem Serumaliquot und zum Antiserum (3 Volumen Cholerafiltrat auf 1 Volumen Serum).
- Bewahren Sie die PCR-Röhrchen in einem PCR 96-Well-Rack oder einer leeren Tip-Box auf und wirbeln Sie sie 5 s lang ein.
- Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 °C mit einem Thermocycler.
- Die Proben werden 30 Minuten lang bei 56 °C inkubiert, um das Cholerafiltrat mit einem Thermocycler zu inaktivieren.
Anmerkung: Je nach Thermocycler kann dieser Schritt programmiert werden, um den Prozess weiter zu automatisieren.
- Bewahren Sie die PCR-Röhrchen in einem PCR 96-Well-Rack oder einer leeren Tip-Box auf und wirbeln Sie sie 5 s lang ein.
- Lagern Sie die Proben bei 4 °C im Kühlschrank, bis sie für den HI-Test verwendet werden.
- HI-Assay
Anmerkung: Für eine Veranschaulichung des Prinzips des HI-Assays siehe Abbildung 1. Je nach Virus werden unterschiedliche Spezies von Erythrozyten für den Assay verwendet (Tabelle 1). Die verschiedenen Spezies von Erythrozyten werden in verschiedenen Arten von 96-Well-Platten verwendet, und die Inkubationszeit sowie das Aussehen der nicht agglutinierten Zellen unterscheiden sich (Tabelle 2). Für den HI-Assay werden 4 HA-Einheiten des Virus oder Antigens zu der 2-fachen Verdünnungsreihe der Proben hinzugefügt.
- Herstellung der Antigenlösung
- Berechnen Sie das benötigte Volumen der Antigenlösung entsprechend der Anzahl der verwendeten 96-Well-Platten (25 μl Antigen pro Well × 96 = 2.400 μl Antigen pro 96-Well-Platte; fügen Sie 100 μl zusätzlich pro Platte hinzu, da ein Reservoir für die Mehrkanalpipette verwendet wird; insgesamt 2,5 ml Antigen pro Platte).
Anmerkung: Wenn beispielsweise 100 Serumproben gemessen werden, werden 10 Platten benötigt (10 Proben pro Platte): 2,5 ml x 10 = insgesamt 25 ml Antigenlösung.
- Bereiten Sie die richtige Verdünnung von 4 HA-Einheiten für das berechnete Volumen mit PBS vor.
HINWEIS: Für den HA-Assay werden 4 HA-Einheiten bestimmt. Für die entsprechende Antigenmenge dividieren Sie das berechnete Volumen durch den Titer, der 4 HA-Einheiten entspricht. Zum Beispiel entsprechen 4 HA-Einheiten einer Verdünnung von 1/64, und wir benötigten 15.000 μl Antigenlösung: 15.000/64 = 234,4 μl des gelösten lyophilisierten Influenzaantigens werden hinzugefügt.
- Vorbereitung der RBC-Suspension
- Berechnen Sie das benötigte Volumen der Erythrozytensuspension entsprechend der Anzahl der verwendeten 96-Well-Mikrotiterplatten (50 μl Erythrc-Suspension pro Well × 96 = 4.800 μ0 μl Erythrox-Suspension pro 96-Well-Platte; fügen Sie 200 μl zusätzlich pro Platte hinzu, da ein Reservoir für die Mehrkanalpipette verwendet wird).
- Die Erythrozyten-Stammsuspension (normalerweise 10 % v/v; außer menschlicher Typ O) mit PBS verdünnen, um die für Erythrozyten bei Vögeln und Säugetieren geeigneten Konzentrationen von 0,75 % bzw. 1 % zu erreichen.
- Vorbereitung der 96-Well-Mikrotiterplatte
- Markieren Sie die 96-Well-Mikrotiterplatten (Proben-ID, Positivkontrolle und Rücktitration). Bitte überprüfen Sie die Ausrichtung der Platte in Abbildung 5 sorgfältig.
- Geben Sie 25 μl PBS mit der Mehrkanalpipette in jede Vertiefung mit Ausnahme der ersten Vertiefung der "Back-Titration"-Reihe (Abbildung 5, 12. Reihe).
Anmerkung: Es wurde eine Rücktitration durchgeführt, um zu überprüfen, ob die verwendete Antigenverdünnung 4 HA-Einheiten beträgt. Ein Antigentiter von 4 HA-Einheiten ist indiziert, wenn die Hämagglutination in den ersten drei Vertiefungen der "Back-Titration"-Reihe auftritt, nicht jedoch in der vierten Vertiefung.
- 50 μl der vorbereiteten Antigenlösung (beschrieben in 5.2.1) in die erste Vertiefung der "Rückentitration" (12. Reihe) geben.
- Geben Sie 25 μl der RDE-behandelten Serumproben mit der Mehrkanalpipette in die ersten Vertiefungen der Reihen 1 bis 10 auf jeder Platte.
- Geben Sie 25 μl des entsprechenden Anti-Serums als Positivkontrolle in die erste Vertiefung der 11. Reihe.
- Führen Sie serielle 2-fache Verdünnungen durch, indem Sie 25 μl aus der ersten Vertiefung jeder Reihe (1 - 12) mit einer Mehrkanalpipette in aufeinanderfolgende Vertiefungen übertragen. Mischen Sie, indem Sie bei jedem Verdünnungsschritt 10 - 15 Mal auf und ab pipettieren. Die gleichen Spitzen können für jeden Verdünnungsschritt pro Probe verwendet werden.
- Entsorgen Sie die letzten 25 μl der letzten Vertiefungen.
- Geben Sie 25 μl der Antigenlösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Reihen 1 bis 11 (Serumproben und Antiserum). Die gleichen Spitzen können verwendet werden, wenn sie die Vertiefungen nicht berühren.
- Geben Sie 25 μl PBS anstelle von Antigen in jede Vertiefung der Reihe "Rückentitration" (12. Reihe).
- Zum Mixen 10 Mal vorsichtig an allen vier Seiten auf den Teller klopfen.
- Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bewegen Sie die Platte während der Inkubation nicht.
- Geben Sie 50 μl der RBC-Suspension in jede Vertiefung.
- Zum Mixen 10 Mal vorsichtig auf alle 4 Seiten auf den Teller klopfen.
- Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie sie je nach verwendeter Erythrozytenspezies so lange wie vorgesehen bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 2). Bewegen Sie die Platte während der Inkubation nicht.
- Ablesen der Platte
Anmerkung: Der HI-Titer ist der Kehrwert der letzten Verdünnung von (Anti-) Serum, der die Hämagglutination vollständig hemmt. Es ist wichtig zu berücksichtigen, dass die RDE-behandelten Seren bereits 1:4 verdünnt wurden und nach dem seriellen Verdünnungsschritt die Seren in den ersten Wells 1:8 verdünnt werden, was einem HI-Titer von 8 entspricht.
- Auslesung von aviären RBCs
- Kippen Sie die Platte um 90° für 25 s.
Anmerkung: Das Kippen der Platte ist entscheidend für die Unterscheidung von Vogelmustern, da alle drei verschiedenen Arten von Agglutinationsmustern (vollständig agglutiniert, teilweise agglutiniert und nicht agglutiniert) als Knopf erscheinen, wenn sie nicht gekippt werden.
- Markieren Sie die Ergebnisse sofort, während sich die Platte noch in einer gekippten Position befindet, auf einem gedruckten Schema der 96-Well-Platte. Die Agglutinationsmuster von aviären Erythrozyten sind in Abbildung 3 dargestellt.
Tabelle 1: Influenza-Antigene und entsprechende Spezies von Erythrozyten. Gemäß den Anweisungen des Herstellers (NIBSC).
| Influenza-Antigen | A/Kalifornien/7/09 (H1N1) | A/Schweiz/9715293.2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 |
| RBC-Spezies | Huhn | Meerschweinchen | Meerschweinchen | Turkei | Turkei |
Tabelle 2: Assay-Bedingungen mit verschiedenen Arten von Erythrozyten.Gemäß dem WHO-Protokoll. (* fließt beim Kippen).
| RBC-Spezies | Huhn | Turkei | Meerschweinchen | Mensch Typ O |
| Konzentration der Erythrozyten (v/v) | 0,75 % | 0,75 % | 1 % | 1 % |
| Art der Mikrotiterplatte | V-Boden | V-Boden | U-Boden | U-Boden |
| Inkubationszeit, RT | 30 Minuten | 30 Minuten | 1 Stunde | 1 Stunde |
| Aussehen von nicht verklebten Zellen | Knopf* | Knopf* | Heiligenschein | Heiligenschein |
