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>1. Polarisation von HMDM
- Bereiten Sie das M1-Priming-Medium unter sterilen Bedingungen vor, indem Sie dem vollständigen RPMI-1640-Nährmedium Interferon-γ (IFNγ; 20 ng/ml) und Lipopolysaccharid (LPS; 1 μg/ml) hinzufügen. Bereiten Sie das M2-Priming-Medium vor, indem Sie Interleukin 4 (IL-4; 20 ng/ml) zu dem vollständigen RPMI-1640-Kulturmedium hinzufügen.
- Unter sterilen Bedingungen wird das Medium aus den Vertiefungen der Gewebekulturplatte aspiriert, die die von humanen Monozyten abgeleiteten Makrophagen, HMDM, enthalten, die wie in Abschnitt 1 beschrieben ausgesät und kultiviert wurden.
- Waschen Sie die Vertiefungen, die die Zellen enthalten, vorsichtig 3x mit sterilem PBS (vorgewärmt auf 37 °C) unter Verwendung von 1 mL PBS-Aliquoten.
- Geben Sie 1 ml des M1- oder M2-Priming-Mediums in jede Vertiefung, die das HMDM enthält (je nachdem, was für das Experiment geeignet ist).
- Die Zellen werden 48 h lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Zellinkubator inkubiert.
>2. Stimulation von HMDM zur Induktion der MET-Freisetzung
- Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen das Kulturmedium vor, das verschiedene Stimulatoren für die Freisetzung der extrazellulären Fallen von Makrophagen (je nachdem, welcher Wert für den Versuch geeignet ist) auf das vollständige RPMI-1640-Medium vor: PMA (25 nM), humanes rekombinantes TNFα (25 ng/ml) oder humanes rekombinantes IL-8 (50 ng/ml).
- Für Experimente mit hypochloriger Säure, HOCl-Stimulation, bereiten Sie HOCl (200 μM) in HBSS (vorgewärmt auf 37 °C) unmittelbar vor der Zugabe zu den Zellen vor. Stellen Sie sicher, dass der HOCl nicht in vollständigen Zellmedien hergestellt wird.
Anmerkung: Die Konzentration der Stammlösung von HOCl wird quantifiziert, indem die UV-Absorption der Lösung bei 292 nm und pH = 11,6 und unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 350 M-1 cm-1 gemessen wird.
- Nach der in Abschnitt 2 beschriebenen Polarisationsbehandlung aspirieren Sie die Zellmedien aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit 1-ml-Aliquoten von sterilem PBS (für PMA, TNFα und IL-8) oder HBSS (für HOCl), die auf 37 °C vorgewärmt wurden.
- Für Experimente mit PMA, TNFα oder IL-8: Fügen Sie 1 ml des vollständigen Mediums hinzu, das PMA, TNFα oder IL-8 enthält, nachdem Sie das PBS im letzten Waschschritt entfernt haben.
- Für Experimente mit TNFα werden die Zellen 6 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Zellinkubator inkubiert. Für Experimente mit PMA und IL-8 werden die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Zellinkubator inkubiert.
- Für Experimente mit HOCl fügen Sie 1 ml HOCl in HBSS hinzu, nachdem Sie das HBSS im letzten Waschschritt entfernt haben. Anschließend werden die Zellen 15 Minuten lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Zellinkubator inkubiert.
- Den Zellüberstand vorsichtig aspirieren und die Zellen 3x mit 1 ml HBSS-Aliquoten waschen, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
- Nachdem Sie das HBSS aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, fügen Sie 1 ml des vollständigen RPMI-1640-Nährmediums hinzu. Anschließend werden die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Zellinkubator inkubiert.
>3. Visualisierung von MET in lebenden Zellkulturen
- Bereiten Sie den grünen Farbstoff SYTOX in HBSS in einer Konzentration von 40 μM vor.
- Am Ende der in Abschnitt 2 beschriebenen Behandlungen zur Induktion der MET-Freisetzung sind 25 μl 40 μM des Farbstoffs direkt in jede Vertiefung zu geben, die HMDM enthält.
- Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT) für 5 Minuten im Dunkeln.
- Platzieren Sie das HMDM in Gewebekulturvertiefungen auf dem Mikroskoptisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops für die Bildgebung.
- Mikroskopische Verfahren
- Schalten Sie eine Breitspektrum-Leuchtstofflampe, eine Hellfeld-Lichtquelle und ein inverses Mikroskop ein, die mit einer hochauflösenden Farb-Digitalkamera installiert sind (siehe Materialtabelle).
- Drehen Sie das Filterrad in die Position "Nummer 2" für grüne Fluoreszenz (Anregung = 504 nm, Emission = 523 nm) für die Abbildung der grün gefärbten Proben, die in den Gewebekulturvertiefungen enthalten sind.
- Fokussieren Sie das Bild mit dem 5-fach-Objektiv mit dem Grobfokus und dann mit den Feinfokusknöpfen am Mikroskop, bis das Bild durch das Mikroskopokular scharf, klar und scharf erscheint.
- Schalten Sie das Mikroskop in den Kameramodus.
- Starten Sie die zugehörige Software.
- Wählen Sie in der Software die Registerkarte "Erfassen" aus.
- Klicken Sie auf die Wiedergabetaste, um eine Vorschau des Bildes anzuzeigen, und stellen Sie den Feinfokussierknopf am Mikroskop ein, bis das Bild im Software-Vorschaufenster scharf, klar und scharf erscheint.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnehmen.
Anmerkung: Das aufgenommene Bild wird automatisch in der zugehörigen Software angezeigt.
- Klicken Sie in der Software auf Datei | Speichern Sie unter dem erforderlichen Bilddateityp.
- Drehen Sie am Mikroskop das Filterrad in die Position "Nummer 5" für die Hellfeldbildgebung und wiederholen Sie die Schritte 3.5.2 bis 3.5.9, um das entsprechende Hellfeldbild zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5.2 bis 3.5.10 bei Bedarf für die nachfolgende Bildaufnahme.