Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Reinigung von humanen polymorphkernigen Leukozyten und Isolierung von humanem Serum
HINWEIS: Alle Reagenzien sollten routinemäßig mit einem kommerziell erhältlichen Endotoxin-Nachweiskit auf das Vorhandensein von Endotoxin überprüft werden und sollten <25,0 pg/ml Endotoxin enthalten, um ein unerwünschtes Priming von PMNs zu verhindern.
- Bringen Sie 50 ml 3 % Dextran-0,9 % NaCl (w/v), 35 ml 0,9 % NaCl (w/v), 20 ml 1,8 % NaCl (w/v), 12 ml 1,077 g/ml Dichtegradientenlösung und 20 ml Wasser in Injektions- oder Spülqualität auf Raumtemperatur.
- Um menschliches Serum zu isolieren, inkubieren Sie 4 ml frisch entnommenes menschliches Blut ohne Antikoagulans bei 37 °C in einem 15-ml-Glasröhrchen für 30 Minuten. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 2.000–3.000 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die obere Serumschicht in ein frisches konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.
- Kombinieren Sie 25 ml frisch entnommenes heparinisiertes (1000 Einheiten/ml) menschliches Vollblut mit 25 ml 3 % Dextran-0,9 % NaCl (Verhältnis 1:1) bei Raumtemperatur in zwei replizierten konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (50 mL Gesamtvolumen pro Röhrchen). Mischen Sie, indem Sie jedes konische 50-ml-Röhrchen vorsichtig wiegen und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Nach der Inkubation bei Raumtemperatur erscheinen zwei separate Schichten. Die oberste Schicht jedes Dextran-Blut-Gemisches in neue konische 50-ml-Röhrchen überführen und bei 450 x g für 10 min bei Raumtemperatur mit niedrigen oder keinen Bremsen zentrifugieren.
- Beide Überstände werden vorsichtig abgesaugt und entsorgt, ohne die Zellpellets zu stören. Suspendieren Sie jedes Zellpellet vorsichtig in 2 mL Raumtemperatur 0,9 % NaCl, kombinieren Sie die resuspendierten Pellets in einem einzigen konischen 50-ml-Röhrchen und fügen Sie dann die restlichen 0,9 % NaCl hinzu (Endvolumen von 35 mL).
- Mit einer Handpipette vorsichtig 10 mL Raumtemperatur mit 1,077 g/ml Dichtegradientenlösung unter die Zellsuspension legen. Schleudern Sie bei 450 x g für 30 min bei Raumtemperatur mit niedrigen oder keinen Bremsen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Zellpellet zu stören. Der Überstand enthält mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die wie zuvor beschrieben entnommen werden können.
- Lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie das Zellpellet in 20 ml Wasser mit Raumtemperatur resuspendieren. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Tube 30 Sekunden lang schaukeln. Die Lyse der roten Blutkörperchen geht mit einer deutlichen Abnahme der Trübung einher.
- Sofort 20 mL 1,8 % NaCl (bei Raumtemperatur [RT]) zugeben und die Probe bei 450 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Zeit, in der PMNs nach der Lyse der roten Blutkörperchen allein im Wasser verbleiben, zu minimieren, um die PMN-Ausbeute zu maximieren und eine PMN-Lyse und/oder -Aktivierung zu verhindern.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2 mL RT RPMI 1640 Medium und legen Sie es auf Eis.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie gereinigte PMNs in einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/ml mit eiskaltem RPMI und halten Sie sie auf Eis.
- Kombinieren Sie 100 μl gereinigte PMNs (1 x 106 Zellen) mit 300 μl eiskalter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 1 μl Propidiumiodid-Färbung in zwei Replikations-Durchflusszytometrie-Röhrchen. Für eine Positivkontrolle auf Plasmamembranschäden geben Sie 40 μl 0,5%ige Triton X-100-Lösung in eines der Durchflusszytometrie-Röhrchen und mischen Sie gründlich.
- Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Vorwärtsstreuung, die Seitenstreuung und die Propidiumiodid-Färbung (Anregungs-/Emissionsmaxima bei 535/617 nm) von gereinigten Zellen zu messen (Abbildung 1).
Anmerkung: Die Vorwärts- und Seitwärtsstreuanalyse dient zur Identifizierung unerwünschter Populationen von Lymphozyten und Monozyten. Propidiumiodid färbt nur Zellen mit einer kompromittierten Plasmamembran, und gereinigte PMNs, die ausgeprägte Populationen von Propidiumiodid-positiven Zellen aufweisen, sollten nicht verwendet werden. Für diese Studien wurden gereinigte PMNs nur verwendet, wenn sie >98 % der gereinigten Zellen und <5 % der positiv auf Propidiumiodid gefärbten Zellen ausmachten.
- Bereiten Sie eine 96-Well-Platte für PMN-Zytotoxizitätsassays vor, indem Sie einzelne Wells, die in diesem Assay verwendet werden, mit 100 μl 20 % isoliertem Humanserum beschichten, das mit DPBS verdünnt wurde.
Anmerkung: Das direkte Plattieren von PMNs auf Kunststoff oder Glas führt zur Aktivierung der Zellen. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens eine negative Kontrollvertiefung einschließen, die nur Medien aufnimmt, und mindestens eine positive Kontrollvertiefung, die 0,05 % Triton X-100 erhält.
- Die Platte bei 37 °C 30 min inkubieren. Waschen Sie die beschichteten Vertiefungen nach der Inkubation zweimal mit eiskaltem DPBS, um überschüssiges Serum zu entfernen. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kopf, um DPBS-Reste zu entfernen, und legen Sie sie auf Eis.
- Geben Sie vorsichtig 100 μl gereinigte humane PMNs in einer Menge von 1 x 107 Zellen/ml in jede beschichtete Vertiefung (1 x 106 PMNs/Well). Lassen Sie die PMNs in den Vertiefungen absetzen, indem Sie die Platte mindestens 5 Minuten lang auf Eis inkubieren. Halten Sie die Platte waagerecht, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jeder Vertiefung zu ermöglichen, und lassen Sie sie auf Eis, um eine unerwünschte Aktivierung von PMNs zu vermeiden.
>2. Zytotoxizitätstest von extrazellulären S. aureus-Proteinen gegen humane polymorphkernige Leukozyten
- S. aureus über Nacht in tryptischer Sojabrühe (TSB) mit einem auf 37 °C eingestellten Schüttelbrutkasten kultivieren. Für diese Studien wurden 20 mL TSB in separaten 150 mL Erlenmeyerkolben mit gefrorenen Kulturen der S. aureus-Stämme USA300 oder USA300ΔsaeR/S beimpft und etwa 14 h lang unter Schütteln bei 250 U/min gezüchtet.
- Subkultur S. aureus durch eine Verdünnung der Bakterienkultur über Nacht mit frischem Medium im Verhältnis 1:100. Bei 37 °C unter Schütteln inkubieren, bis die Bakterien die frühe stationäre Wachstumsphase erreicht haben.
Anmerkung: Für diese Versuche wurden 20 ml tryptische Sojabrühe in 150 ml-Erlenmeyerkolben mit 200 μl über Nacht kultiviertem USA300 oder USA300ΔsaeR/S beimpft und bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min für 5 h inkubiert.
- Wenn die Bakterien die frühe stationäre Wachstumsphase erreicht haben, überführen Sie 1 ml subkultivierten S. aureus in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Nach der Zentrifugation wird der Überstand in eine 3-ml-Spritze überführt. Überstände werden durch einen 0,22-μm-Filter in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis geleitet.
- Führen Sie serielle Verdünnungen von Überständen mit eiskalten Medien durch, die zur Kultivierung von S. aureus verwendet werden.
Anmerkung: Für die gezeigten Experimente wurden Überstände von USA300 und USA300ΔsaeR/S vier aufeinanderfolgenden 1/2 log Verdünnungen mit eiskaltem TSB unterzogen.
- Überstandsproben oder Medien allein (für Negativ- und Positivkontrollen) werden vorsichtig in einzelne Vertiefungen von 96-Well-Platten gegeben, die PMNs auf Eis aus Schritt 1.15 enthalten. Für diese Experimente wurden 10 μl USA300 oder USA300ΔsaeR/S Überstandsproben in jede Vertiefung gegeben. Schütteln Sie die Platte sanft, um die Überstände in Vertiefungen zu verteilen und bei 37 °C zu inkubieren.
- Nehmen Sie die Platte zu den gewünschten Zeiten aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 40 μl 0,5 % Triton X-100 in die Positivkontrollvertiefung.
- Pipettieren Sie die Proben vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab, um alle an der Platte haftenden PMNs vollständig zu entfernen, und übertragen Sie die Proben dann in Durchflusszytometrieröhrchen auf Eis, die 300 μl eiskaltes DPBS mit 1 μl Propidiumiodid enthalten.
- Messen Sie den Anteil der Propidiumiodid-positiven PMNs mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2A). Wenn es an DNA gebunden ist, hat Propidiumiodid eine Anregung/Emission bei 535/617 nm.
