Zytotoxizitätstest von Staphylococcus aureus-Stämmen an Neutrophilen nach Phagozytose

Zusammenfassung

Quelle: Dankoff, J. G. et al., Quantifizierung der Zytotoxizität von Staphylococcus aureus gegen humane polymorphkernige Leukozyten. J. Vis. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay zum Nachweis der Zytotoxizität von virulenten und weniger virulenten Staphylococcus aureus-Stämmen gegen humane Neutrophile nach Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

Protokoll

>1. S. aureus-Zytotoxizitätstest gegen humane polymorphkernige Leukozyten nach Phagozytose

HINWEIS: Wachstumskurven, die durch die optische Dichte bei 600 nm (OD600) und die Bakterienkonzentration definiert sind, müssen für die zu testenden S. aureus-Stämme empirisch bestimmt werden, bevor mit diesem Test begonnen wird. Der Erfolg dieser Experimente erfordert die konsistente Ernte gleicher Konzentrationen jedes S. aureus-Stammes, der in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase mit dem OD600 von subkultivierten Bakterien getestet wurde.

1. Beginnen Sie über Nacht mit Kulturen von S. aureus-Stämmen und Subkulturbakterien wie unten beschrieben.
   1. S. aureus über Nacht in tryptischer Sojabrühe (TSB) mit einem auf 37 °C eingestellten Schüttelbrutkasten kultivieren. Für diese Studien wurden 20 ml TSB in separaten 150-ml-Erlenmeyerkolben mit gefrorenen Kulturen der S. aureus-Stämme USA300 oder USA300ΔsaeR/S beimpft und etwa 14 h lang unter Schütteln bei 250 U/min gezüchtet.
   2. Subkultur S. aureus durch eine Verdünnung der Bakterienkultur über Nacht mit frischem Medium im Verhältnis 1:100. Inkubieren bei 37 °C unter Schütteln.
2. Ernten Sie subkultivierte S. aureus, wenn sie ein mittleres exponentielles Wachstum erreicht haben, indem Sie 1 ml kultivierte Bakterien in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 5.000 × g zentrifugieren.
   Anmerkung: Unter unseren Wachstumsbedingungen erreichten USA300 und USA300ΔsaeR/S nach ca. 135 min Inkubation die mittlere exponentielle Wachstumsphase.
3. S. aureus wird nach der Zentrifugation gewaschen, indem der Überstand aspiriert, die pelletierten Bakterien in 1 ml DPBS resuspendiert, die Probe 30 s lang vortexiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 5.000 × g zentrifugiert wird.
4. Opsonisieren Sie S. aureus, indem Sie das Bakterienpellet in 1 ml 20%igem Humanserum, verdünnt mit DPBS, resuspendieren und bei 37 °C unter 15-minütigem Rühren inkubieren.
5. Zentrifugieren Sie opsonisierte Bakterien bei 5.000 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie S. aureus nach der Zentrifugation, indem Sie den Überstand aspirieren, die pelletierten Bakterien in 1 ml DPBS resuspendieren und dann die Probe vortexen, bis das Bakterienpellet vollständig auseinandergebrochen ist, plus weitere 30 Sekunden. Bakterien bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
6. Resuspendieren Sie opsonisierte S. aureus-Stämme in 1 ml RPMI, wirbeln Sie die Probe vortex, bis das Bakterienpellet vollständig auseinandergebrochen ist, und dann für weitere 30 s. Legen Sie die Bakterien auf Eis.
7. Verdünnen Sie opsonisierte S. aureus-Stämme mit eiskaltem RPMI auf die gewünschte Konzentration. 30 s vortexen und auf Eis legen.
8. Bestätigung der Konzentration von opsonisiertem S. aureus durch Plattieren von 1:10 seriellen Verdünnungen von Bakterien auf tryptischem Soja-Agar.
   Anmerkung: Da Unterschiede in der Konzentration der in diesem Assay verwendeten Bakterien einen großen Einfluss auf die nachfolgende Permeabilität der PMN-Plasmamembran haben können (Abbildung 1A), ist es wichtig, dass die Konzentration jedes getesteten Stammes für jedes Experiment bestimmt wird und zwischen den Stämmen gleichwertig ist.
9. Geben Sie vorsichtig 100 μl/Well jedes S. aureus-Stammes oder RPMI (für Positiv- und Negativkontrollen) zu PMNs in der 96-Well-Platte auf Eis. Platte sanft schütteln, um S. aureus in Vertiefungen zu verteilen.
Die
10. Phagozytose wird synchronisiert, indem die Platte 8 Minuten lang bei 4 °C bei 500 × g zentrifugiert wird. Die Platte wird unmittelbar nach der Zentrifugation bei 37 °C inkubiert (T = 0).
11. Nehmen Sie die Platte zu den gewünschten Zeiten aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 40 μl 0,5 % Triton X-100 in die Positivkontrollvertiefung.
12. Pipettieren Sie die Proben vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab, um alle an der Platte haftenden PMNs vollständig zu entfernen, und übertragen Sie die Proben dann in Durchflusszytometrieröhrchen auf Eis, die 200 μl eiskaltes DPBS mit 1 μl Propidiumiodid enthalten.
13. Analysieren Sie Proben für die Propidiumiodid-Färbung mittels Durchflusszytometrie.
14. Messen Sie den Anteil der Propidiumiodid-positiven PMNs mittels Durchflusszytometrie. Wenn es an DNA gebunden ist, hat Propidiumiodid eine Anregung/Emission bei 535/617 nm.

Ergebnisse

Abbildung 1: Durchflusszytometrische Analyse von PMNs nach Phagozytose von S. aureus. (A) Der Anteil der Propidiumiodid-positiven PMNs 90 min nach der Phagozytose unterschiedlicher Konzentrationen von USA300 oder USA300∆saeR/S. (B) Die Konzentration der für die Experimente verwendeten opsonisierten S. aureus-Stämme ist in Panel A dargestellt. Die Daten we...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschlüssen	VWR	Artikel-Nr.: 89000-044	Wird in Waschzellen verwendet
12x75mm Kulturröhrchen	VWR	Tel.: 60818-430	Wird als Durchflusszytometrie-Röhrchen verwendet
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	VWR	Artikel-Nr.: 89039-656	Zum Dosieren von Medien
Bacto Tryptische Sojabrühe, Sojabohnen-Kasein-Digest-Medium	FischerScientific	211823	Für die Züchtung von Zellkulturen
Bright-Line-Hämozytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Gerät zur Zellzählung
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung) mit Calcium und Magnesium	Corning	21-030-CV	Wird in Waschzellen verwendet
Ficoll-Paque PLUS	GE Gesundheitswesen	Artikel-Nr.: 17-1440-02	PMN-Reinigung
Fisherbrand Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol	FischerScientific	13-678-11E	Zum Ansaugen von Flüssigkeit
Greiner CELLSTAR 96 Well Platten	Millipore Sigma	Nr. M0687	Platte zur Aufnahme von Versuchsproben
OMICRON Spritzenvorsatzfilter	Omicron Scientific	SFPV13R	Zum Filtern von Überständen
Propidiumiodid	ThermoFisher Scientific	Nr. P3566	Membranundurchlässiger DNA-Farbstoff
PYREX Marke 4980 Erlenmeyerkolben	Cole-Parmer	Artikel-Nr.: EW-34503-24	Für die Züchtung von Zellkulturen
RPMI 1640, 1X ohne L-Glutamin, Phenolrot	Corning	17-105-CV (Englisch	Wird bei der Resuspendierung von Zellen verwendet
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Positive Kontrolle der Membranintegrität

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