Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Stämme und Kulturbedingungen
Hinweis: In dieser Studie wird der M . tuberculosis-Stamm CDC1551 verwendet, aber jeder M. tuberculosis-Stamm kann auf die gleiche Weise verwendet werden.
- Züchten Sie die Bakterien in M-OADC-TW (7H9 Bouillon ergänzt mit 0,5 % Glycerin, 10 % Ölsäure-Dextrose-Komplex ohne Katalase und 0,05 % Tween-80) Medium bei 37 °C auf einen OD600 von 0,5 (~ 0,2 x 107 koloniebildende Einheit oder KBE).
- Verdünnen Sie die Kultur in M-OADC-TW (Serie von 1:10 Verdünnungen der Bakterien). Die Verdünnungen der Bakterien (10,5, 10,6, 10,7, 10,8) werden in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7H11-Platten plattiert, um die Bestimmung von KBE zu ermöglichen.
- Inkubieren Sie die Platten vier Wochen lang bei 37 °C oder bis die Bienenvölker genau gezählt werden können.
- Zentrifugieren Sie das bakterielle Inokulum bei 8.534 x g für 5 Minuten, um ein Pellet zu erhalten. Waschen Sie das Pellet einmal mit 10 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und suspendieren Sie das Pellet wieder in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
>2. Aerosolinfektion von Mäusen mit einer Madison-Kammer
- Lassen Sie die Mäuse sich eine Woche lang an die neue Umgebung gewöhnen.
- Wiegen Sie die Mäuse, bevor Sie sie in die Kammer laden.
- Stecken Sie drei Kabel in die Steckdosenleiste: die Stromversorgung der Hauptkammer, die Vakuumpumpe und den Luftkompressor, in dieser Reihenfolge.
- Schrauben Sie das Glas vorsichtig ab. Bringen Sie das Glas in die Biosicherheitswerkbank und fügen Sie das in 15 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) suspendierte Challenge-Inokulum hinzu, um ~ 104 - 106 KBE Bakterien in der Lunge zu erreichen.
- Schließen Sie den Deckel des Glases in der Biosicherheitswerkbank. Befestigen Sie das Glas an der Verneblereinheit und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere (Einlass-)Ende etwa einen Viertelzoll unter dem Niveau der Flüssigkeit im Glas liegt.
- Laden Sie alle für das Experiment benötigten Tiere (die Kammer kann bis zu 90 Mäuse aufnehmen) in die Kammer und schließen Sie alle Riegel an der Tür.
- Überprüfen Sie den Hauptluftmengenmesser (Raumluftmesser). Stellen Sie sicher, dass die Mitte des Schwimmers (der Kugel) etwa 50 l/min beträgt, wie auf der Skala links gemessen.
- Drücken Sie die Start-Taste auf dem Bedienfeld der Kammer. Stellen Sie den Luftdurchsatz durch den Luftmassenmesser des Kompressors (den kleineren Zähler auf der linken Seite) auf 4 l/min auf der Skala ein. Überprüfen Sie visuell, ob das Challenge-Inokulum vernebelt wird.
- Wenn nach 15 Minuten das rote Licht an der Vorderseite des Bedienfelds aufleuchtet und ein akustisches Signal das Ende des Laufs anzeigt, drücken Sie die Reset-Taste in der unteren rechten Ecke des Bedienfelds, um die Timer zurückzusetzen.
- Halten Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer gedrückt, um das Vakuum freizugeben.
- Öffne die Kammertür und entferne die Tiere. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihre Käfige.
- Nehmen Sie das Verneblerglas aus dem Glas und legen Sie es in einen verschlossenen, auslaufsicheren Transportbehälter. Stellen Sie den Behälter in die Biosicherheitswerkbank und entsorgen Sie die Challenge-Suspension in einem dafür vorgesehenen Abfallbehälter.
- Legen Sie das gebrauchte Verneblerglas in einen Biohazard-Beutel und verschließen Sie den Beutel für den Transport zum Autoklaven.
- Besprühen Sie am Ende des Infektionsvorgangs das Innere der Kammer mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol und lassen Sie die Kammer 10 Minuten lang ruhen.
- Wischen Sie dann alle zugänglichen Innenflächen sehr gründlich ab. Entsorgen Sie alle kontaminierten Papierhandtücher usw. im Biohazard-Müll. Autoklavieren Sie den Müll, die Abfallbehälter und die gebrauchten Verneblergläser.
- Bringen Sie die Tiere bis zum Zeitpunkt der Bildgebung wieder in den Sicherheitsraum.
- Am Tag der Bildgebung werden die Tiere in einem zweiten Behälter in den Bildgebungsraum gebracht.
>3. Tieranästhesie
- Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran mit einem maßgeschneiderten Gasanästhesiesystem.
- Wiegen Sie jeden der beiden Aktivkohlefilterbehälter, die sich auf dem Anästhesiegerät befinden.
- Ersetzen Sie es durch einen neuen Kanister, wenn das Gewicht 50 g über dem ursprünglichen Gewicht liegt.
- Überprüfen Sie die Verdampfereinheit, um sicherzustellen, dass genügend Isofluran für das Verfahren vorhanden ist.
- Platzieren Sie den Nasenkonushalter in der Bildgebungskammer. Platzieren Sie die für den Eingriff erforderliche Anzahl von Nasenkonen und verschließen Sie die restlichen Öffnungen mit den Nasenkonusblockern.
- Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruckzylinder ein und stellen Sie sie auf 55 psi ein.
- Schalten Sie die Evakuierungspumpe ein, die sich vor dem Anästhesiegerät befindet, und stellen Sie sie auf 8 l/min ein.
- Schalten Sie den Sauerstoffschalter ein, der sich vor dem Anästhesiegerät befindet.
- Schalten Sie den Gasfluss zur Anästhesie-Induktionskammer ein, um den Gasfluss auf 1,5 l/min einzustellen. Schalten Sie den Gasfluss aus.
- Schalten Sie den Gasfluss zur Bildgebungskammer ein, um den Gasfluss auf 0,25 l/min einzustellen. Schalten Sie den Gasfluss aus.
- Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein und stellen Sie ihn auf 2 - 2,5% ein. Der Isofluranspiegel wird entsprechend der Anzahl und dem Gewicht der für das Experiment verwendeten Tiere angepasst, indem der Drehknopf am Isofluran-Verdampfer gedreht wird (2 - 2,5 % für eine Maus mit einem Gewicht von ~20 g; 4 % für ein Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 g).
- Legen Sie die Mäuse in die Anästhesiekammer und schließen Sie den Deckel. Schalten Sie den Gasfluss zur Anästhesie-Induktionskammer ein.
- Lassen Sie die Mäuse 5 - 10 min in der Anästhesie-Induktionskammer, bis sie vollständig betäubt sind.
- Sobald die Mäuse betäubt sind, tragen Sie eine optische Salbe auf die Augen auf, um sie während der Bildgebung zu schützen.
- Platzieren Sie die Mäuse in Bauch- oder Sternumlage, so dass ihre Nasen in den Nasenkonus gelegt werden, um die Anästhesie der Mäuse während des bildgebenden Verfahrens zu erleichtern.
>4. Bildgebung der Reporterenzymfluoreszenz (REF)
- Injizieren Sie das Substrat (20 μM, 2,5 μl/g Gewicht) durch intraperitoneale Injektion sowohl in die infizierten als auch in die Kontrollmäuse. Die Mäuse stehen in der Bildgebungskammer für weniger als 1 Minute unter Narkose.
- Starten Sie das Imaging-System.
- Initialisieren Sie das System, indem Sie auf Initialisieren klicken. Warten Sie, bis der Temperaturbalken grün wird.
Anmerkung: Die Bildgebungskammer besteht aus einer beheizten Plattform, um die Körpertemperatur des Tieres während der Bildgebung zu halten.
- Wählen Sie für die Bildaufnahmeeinstellung Fluoreszierend | Trans-Illumination für ganze Tiere oder Epi-Illumination für Lungengewebe, Struktur und Overlay im Acquisition Control Panel.
- Stellen Sie das Sichtfeld für eine einzelne Maus auf B und die Lampenstärke auf hoch ein.
- Stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto, Medium Binning, 2 - 3 für Blende und Anregungsfilter auf 745 nm und Emissionsfilter auf 780 nm bis 840 nm ein.
- Klicken Sie zum Einrichten der Sequenz auf Sequenz einrichten und wählen Sie 9 - 12 Trans-Beleuchtungspunkte im Lungenbereich aus.
- Klicken Sie auf Erfassen für die Bildaufnahme.
- Setzen Sie die Maus nach dem Imaging wieder in den Käfig ein.
- Überwachen Sie die Mäuse, bis sie sich vollständig erholt haben, oder opfern Sie sie für die Quantifizierung der KBE, wenn die Bildgebung zu einem bestimmten Zeitpunkt des Experiments erfolgt. Führen Sie einen modifizierten Karnofsky-Score durch, um das Wohlbefinden von Mäusen nach der Bildgebung zu überwachen.
