Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Isolierung und Differenzierung von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs)
- Tag 0: 4 - 6 Wochen alte weibliche C57BL/6- oder BALB/c-Maus in einer CO2 -Kammer opfern und Tod durch Gebärmutterhalsluxation bestätigen. Stellen Sie die Sterilisation von Scheren und Pinzetten sicher, indem Sie sie in 70%igem Ethanol getränkt halten. Sprühen Sie die Handschuhe mit 70 % Ethanol ein, um eine sterile Handhabung während des gesamten Prozesses der Isolierung von Knochenmarkzellen zu ermöglichen.
- Befestigen Sie die geopferte Maus auf dem Sezierbrett, indem Sie ihre Vordergliedmaßen feststecken und sie durch reichliches Besprühen mit 70% Ethanol desinfizieren.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer Schere in der Nähe des Hüftgelenks. Führen Sie vorsichtig eine Schere unter die Haut ein, um den darunter liegenden Muskel zu trennen, und schneiden Sie die Haut um das Hüftgelenk auf.
Anmerkung: Das Präparierbrett kann gedreht werden, um einen besseren Zugang zum Hüftgelenk zu ermöglichen.
- Entfernen Sie vorsichtig die behandschuhte Haut vom Bein, indem Sie sie in Richtung Knöchel ziehen und entfernen. Schneiden Sie den Fuß am Knöchel ab und achten Sie sehr darauf, am oder unterhalb des Sprunggelenks zu schneiden, um das Schienbein vollständig intakt zu lassen.
Anmerkung: Das Wadenbein ist in diesem Stadium locker befestigt und lässt sich mit der Pinzette leicht lösen.
- Lokalisieren Sie das Hüftgelenk manuell, indem Sie den Oberschenkelknochen manipulieren, um den Drehpunkt zu identifizieren. Trennen Sie das Bein oberhalb des Hüftgelenks vorsichtig mit einer Schere ab, um den proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt zu lassen.
- Entfernen Sie mit einer Schere so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich aus dem Bein. Entfernen Sie die verbleibende Haut am Knöchel und überschüssiges Knochenmaterial über dem Hüftgelenk.
- Legen Sie die gereinigten Beinknochen in steriles RPMI des Roswell Park Memorial Institute, das mit Penicillin/Streptomycin (1% Endkonzentration) ergänzt wurde, in eine Petrischale auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.6, um das Schienbein und den Oberschenkelknochen vom anderen Hinterbein zu isolieren.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Muskeln und Bindegewebe von den Knochen, indem Sie mit einer sterilisierten Pinzette und einer sterilen Klinge #10 in RPMI getränkt sind.
- Lege die Knochen auf den Deckel der Petrischale. Schneiden Sie das Schienbein vorsichtig mit der Klinge direkt über dem Sprunggelenk ab, um Zugang zum Knochenmark zu erhalten. Entfernen Sie das Schienbein vom Rest des Beins, indem Sie direkt unterhalb des Kniegelenks schneiden.
- Ziehen Sie 10 ml steriles RPMI, das mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) ergänzt ist, in eine 10-ml-Spritze und setzen Sie eine 25-g-Nadel ein.
- Halten Sie das Schienbein mit einer Pinzette senkrecht über einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis fest. Verwenden Sie die Spritze, um vorsichtig ca. 5 ml RPMI in das Ende des Knochens zu injizieren, um das Knochenmark aus dem anderen Ende in den konischen Schlauch zu spülen. Spülen Sie das Knochenmark mit insgesamt 10 ml RPMI, bis der Knochen weiß wird.
Anmerkung: Nach einer gründlichen Spülung sollte sich der Knochen weiß verfärben. Wenn nicht, fahren Sie mit dem Spülen fort, um das Knochenmark zu entfernen. Das distale Ende der Tibia muss möglicherweise mit der Klinge zurückgeschnitten werden, wenn es zu schmal ist, um die Nadel einzuführen.
- Schneiden Sie den Oberschenkelknochen unmittelbar über dem Kniegelenk und unmittelbar unterhalb des Hüftgelenks ab, um beide Enden des Knochens freizulegen und Zugang zum Knochenmark zu erhalten. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen mit insgesamt 10 ml RPMI auf die gleiche Weise wie die Tibia.
- Wiederholen Sie die Reinigungs- und Spülschritte 1.6 bis 1.13 mit den verbleibenden Knochen und sammeln Sie die gespülten Knochenmarkzellen in einem einzigen konischen 50-ml-Röhrchen
Anmerkung: Wenn ein Knochen an irgendeiner Stelle während der Dissektion vor der Knochenspülung bricht, verwenden Sie nicht das Knochenmark von diesem Knochen.
- Das konische Röhrchen, das zur Entnahme des aus allen vier Knochen gespülten Knochenmarks verwendet wird, wird 10 min lang bei 4 °C bei 300 x g zentrifugiert.
- 60 ml steriles BMM-Medium (RPMI) mit einer Endkonzentration von 20 % fötalem Rinderserum, FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1,2 mM Na-Pyruvat, 25 μg/ml humanem Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) in einen 175 cm großen 2-Zell-Kulturkolben mit Filterkappe geben.
- Der Überstand wird nach der Zentrifugation verworfen und das Zellpellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit 5 ml BMM-Medium aus dem Kolben resuspendiert.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in den Kulturkolben und spülen Sie das konische Röhrchen zweimal mit BMM-Medium aus dem Kulturkolben, um eine maximale Zellrückgewinnung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension gründlich in ein Medium gemischt wird, und verteilen Sie 30 ml aus dem ursprünglichen 175 cm 2-Zell-Kulturkolben in einen zweiten 175 cm2-Zell-Kulturkolben mit Filterkappe.
- Beide Kolben mit jeweils 30 ml Zellsuspension werden über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubiert, um die Trennung von kontaminierenden Fibroblasten, residenten Makrophagen und anderen adhärenten Zellen zu ermöglichen.
- TAG 1: Den Überstand mit undifferenzierten Knochenmarkzellen aus Kolben in 100 mm x 15 mm große, nicht TC-behandelte Polystyrol-Petrischalen mit ca. 10 ml/Schale überführen und bei 37 °C, 5 % CO 2 inkubieren.Entsorgen Sie die Kolben.
- TAG 3 oder 4: Geben Sie zusätzlich 5 mL BMM-Medium (vorgewärmt auf 37 °C) in jede Petrischale und setzen Sie die Inkubation bei 37 °C, 5 % CO2 fort.
>2. Beschichtung von BMMs auf Deckgläsern für Infektionen (TAG 7 oder 8)
- Bereiten Sie 6-Well-Gewebekulturplatten vor, indem Sie vier (4) sterile 12-mm-Glasdeckgläser (autoklaviert und in einem geschlossenen Glasbehälter aufbewahrt) in den Boden jeder leeren Vertiefung legen.
Anmerkung: Entnehmen Sie jedes sterile 12-mm-Deckglas mit einer Aspirationsspitze, die an einer Vakuumleitung befestigt ist. Legen Sie Deckgläser ohne Überlappung in die Vertiefungen und lösen Sie sie an der gewünschten Position, indem Sie das Rohr zusammendrücken, um das Vakuum zu unterbrechen.
- Aspirieren Sie Medien (und alle nicht adhärenten Zellen) aus Petrischale, die mit adhärenten Makrophagen aus dem Knochenmark beschichtet sind, und spülen Sie adhärente Zellen vorsichtig 2x mit steriler, auf 37 °C vorgewärmter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesiumchlorid (PBS -/-).
- Geben Sie tropfenweise 5 mL sterile 1x PBS -/- mit einer Endkonzentration von 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in jede Petrischale und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei 37 °C, um anhaftende BMMs zu lösen. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen mit einem Mikroskop abgelöst wurden.
- Sammeln Sie alle abgelösten Zellen, die in 1x PBS -/- ergänzt mit 1 mM EDTA in einem konischen 50-ml-Röhrchen suspendiert sind. Spülen Sie jede Schale 2x mit 5 mL PBS -/- aus und geben Sie sie in das Zellsuspensionsbecken.
Anmerkung: Die Zellsuspension kann mit zusätzlichem PBS -/- verdünnt werden, um Makrophagen während des Entnahmeprozesses vor EDTA-Toxizität zu schützen.
- Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Überstand verwerfen und Makrophagen in 5 - 10 mL BMM-Medium durch Pipettieren resuspendieren. Legen Sie die resuspendierten Zellen auf Eis, um ein Anhaften an den Röhrchen und Verklumpen zu verhindern.
- Zählen Sie lebensfähige Zellen mit dem Trypanblau-Ausschluss im Hämozytometer.
Anmerkung: Zur Zählung von BMM-Zellen, die in 5 ml Medium resuspendiert sind, ermöglicht eine Verdünnungsmischung aus 25 μl Zellsuspension in 445 μl PBS -/- und 30 μl 0,4 % Trypanblau-Lösung in der Regel eine einfache Quantifizierung in einem Hämozytometer (unter Berücksichtigung eines 20-fachen Verdünnungsfaktors für die endgültige Berechnung). Zählen Sie nur Zellen, die nicht mit Trypanblau gefärbt wurden (lebensfähige Zellen). Das Volumen der Zellsuspension kann verändert werden, wenn diese Mischung zu konzentriert oder verdünnt ist. Im Allgemeinen variiert die Ausbeute an BMM pro Präparat zwischen 2 x 107 und 5 x 107 Zellen mit einer einzigen Maus.
- Bereiten Sie die Zellsuspension in BMM-Medium in der gewünschten Beschichtungskonzentration (5 x 105/ml) vor und dispergieren Sie die Suspension auf 6 Well-Platten in 2 mL Medium pro Well, so dass jede Vertiefung 1 x 106 Makrophagen aufnimmt.
Anmerkung: Dies ist ein kritischer Schritt, der sicherstellt, dass jede Vertiefung eine ausreichende Anzahl von Makrophagen erhält, um die Deckgläser gleichmäßig zu bedecken. Vergewissern Sie sich, dass sich die Deckgläser in den Vertiefungen nicht überlappen oder im Medium schwimmen. Wenn ja, stellen Sie es vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze ein.
- Über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 inkubieren.
>3. Reinigung von infektiösen Formen von Leishmania amazonensis
HINWEIS: Bereiten Sie Leishmanien auf Infektionen vor - reinigen Sie metazyklische Promastigoten aus stationären Promastigotenkulturen, oder differenzieren Sie Promastigoten in Kultur in Amastigotenform unter Verwendung des Standardprotokolls für die axenische Differenzierung von L. amazonensis.
- Reinigung von metazyklischen Leishmania-Promastigoten mit Hilfe von Dichtegradientenmedien (Materialien)
- Bereiten Sie eine 40%ige Stammlösung aus Dichtegradientenmedien in sterilem, endotoxinfreiem Wasser vor.
- Verdünnen Sie die Dichtegradientenlösung in 10x M199 Medium (ohne Serum), um eine 10%ige Konzentration im M199 Medium herzustellen.
- Filtern Sie alle Lösungen durch einen 0,22 μm Filter.
Anmerkung: Stammlösungen können bei 4 °C im Dunkeln nicht länger als 1 Monat gelagert werden.
- Geben Sie 2 ml Medienlösung mit 40 % Dichte in den Boden eines konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchens.
- Schicht 2 ml einer Medienlösung mit 10 % Dichtegradient in M199 auf die Medienschicht mit 40 % Dichtegradient vorsichtig auftragen, wobei eine Pasteurpipette verwendet wird, um eine Vermischung zwischen den beiden Schichten zu vermeiden.
- 1 x 109 Parasiten aus der stationären Phase durch Zentrifugation bei 1.900 x g für 10 min sammeln.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 6 mL Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM).
- Schicht 2 ml der Zellsuspension direkt auf die Medienschicht mit 10 % Dichtegradienten, vorsichtig mit einer Pasteurpipette, um eine Vermischung zwischen den Schichten zu vermeiden.
- Zentrifugieren Sie den Gradienten 10 min lang bei 1.300 x g bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Aufgrund der unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften zwischen den Leishmanien-Arten müssen die Zentrifugationsbedingungen für jede Leishmanien-Spezies möglicherweise leicht angepasst werden, um eine maximale Ausbeute zu gewährleisten.
- Sammeln Sie Parasiten (angereichert in metazyklischer Promastigotenform) aus der Bande, die an der oberen Grenze des 10%-Dichtegradienten-Mediums (Grenzfläche zwischen den 0%- und 10%-Dichtegradienten-Medienschichten) gebildet wird.
- Verdünnen Sie die Parasiten mit einem Volumen DMEM und sammeln Sie sie durch Zentrifugation (1.900 x g für 10 min bei Raumtemperatur).
- Resuspendieren Sie in 500 μl DMEM-Medium und zählen Sie in einem Hämozytometer, um die Ausbeute zu quantifizieren.
- Erzeugung von L. amazonensis amastigotes unter axenischen Kulturbedingungen (niedriger pH-Wert / erhöhte Temperatur)
- Mischen Sie 5 ml Promastigotenkultur in logarithmischer Phase (pH 7,4 bei 26 °C) mit einem gleichen Volumen Amastigotenmedium (pH 4,5) unter Verwendung von 25 cm2 Kolben (insgesamt 10 ml Medium) und inkubieren Sie über Nacht bei 26 °C.
- Den Kolben von 26 °C auf 32 °C umstellen.
- Nach 3 bis 4 Tagen 1:5 in Amastigotenmedien bei 32 °C teilen.
- Überprüfen Sie die Parasiten in den nächsten 3 - 4 Tagen (maximal 7 Tage), um zu sehen, ob sie für den Einsatz bei Infektionen bereit sind.
Anmerkung: Gesunde axenische Amastigoten sollten eine ovale Form ohne sichtbare Geißeln haben. Teilweise differenzierte Amastigoten haben eine große ovale Form mit kurzen Geißeln. Die Kultur sollte nicht viele Klumpen aufweisen – viele Klumpen sind ein Hinweis auf nicht wachsende, absterbende Parasiten. Die Amastigotenkultur kann 1:5 geteilt und maximal 3 Wochen lang aufbewahrt werden.
>4. Infektion mit L. amazonensis
- Verdünnen Sie die Parasitensuspensionen entsprechend der gewünschten Infektionsvielfalt (MOI) (in der Regel 3-5 metazyklische Promastigoten pro Makrophage [MOI von 1:3 oder 1:5] und 1 Amastigot pro Makrophage [MOI 1:1]). Geben Sie Leishmania in PBS -/- in einem Volumen von 50 - 100 μl in jede Vertiefung, die bereits 2 mL Medium enthält.
- BMMs für 1 h mit Amastigoten und 3 h mit metazyklischen Promastigoten bei 34 °C zur Infektion inkubieren.
Anmerkung: Die optimale Infektionstemperatur kann je nach Art variieren.
- Nach der Inkubation die freien Parasiten in jeder Vertiefung 3x mit 2 mL PBS -/- gründlich abwaschen, auf 37 °C vorgewärmt.
Anmerkung: Dispergieren Sie PBS vorsichtig, um sicherzustellen, dass Deckgläser nicht übereinander schwimmen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und saugen Sie dann die Flüssigkeit ab. Verwenden Sie eine separate Absaugspitze, wenn Sie mehrere Parasitenstämme verwenden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
- Fixieren Sie Proben zu einem Zeitpunkt von 1 h oder 3 h, indem Sie jede Vertiefung 10 Minuten lang mit 1,5 - 2 mL 2% PFA in PBS -/- inkubieren. Waschen Sie 3x mit PBS -/-. Aspirieren Sie die letzte Wäsche nicht und kühlen Sie Platten mit Deckgläsern in PBS nicht, bis sie fleckig geworden sind.
- Geben Sie 2 ml frisches BMM-Medium in jede Vertiefung auf Platten für weitere Zeitpunkte und inkubieren Sie bei 34 °C.
- Befestigen Sie die verbleibenden Zeitpunkte wie in Schritt 4.3 beschrieben und kühlen Sie die Platten bis zum Färben.
>5. 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) Färbung und Deckglasmontage
- Aspirieren Sie PBS aus Vertiefungen mit Deckgläsern und fügen Sie 1,5 mL PBS -/- mit 0,1 % nichtionischem Reinigungsmittel hinzu. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, gefolgt von 3x Waschen mit 2 mL PBS -/-.
- 1 ml PBS -/- mit 2 μg/ml DAPI (verdünnt von 5 mg/ml Stammlösung in Wasser) in Vertiefungen mit Deckgläsern geben und weitere 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Anmerkung: Die Inkubationszeit mit DAPI ist entscheidend für die korrekte Visualisierung von intrazellulären Leishmania-Parasiten. Makrophagenkerne färben sich aufgrund ihrer größeren Größe und ihres Gehalts an Desoxyribonukleinsäure (DNA) schnell, aber die Färbung der Zellkerne der intrazellulären Parasiten ist langsamer. Daher ist eine Verlängerung der Inkubationszeit über das hinaus, was für die Visualisierung der BMM-Kerne erforderlich ist, notwendig, damit DAPI die Plasmamembran des Parasiten und die Kernmembran des Parasiten durchdringen kann. Mit der richtigen DAPI-Färbung kann neben der Kern-DNA auch die mitochondriale Kinetoplasten-DNA in der Nähe der Flagellentasche des Parasiten sichtbar gemacht werden.
- Waschen Sie jede Vertiefung mit Deckgläsern 3x mit 2 mL PBS -/- und heben Sie dann die Deckgläser mit einer Pinzette an und drehen Sie sie um, um die Zellseite nach unten zu legen und mit einem handelsüblichen Antifading-Einbettreagenz auf Glasobjektträger zu montieren.
Anmerkung: Deckgläser sind extrem zerbrechlich und erfordern einen vorsichtigen Umgang. Vermeiden Sie es, beim Anheben Druck auf sie auszuüben, insbesondere nicht gegen die Seitenwand der Vertiefungen. Die Zugabe von ein paar Tropfen PBS -/- reduziert die Oberflächenspannung zwischen dem Deckglas und der Vertiefung und erleichtert den Hebevorgang. Eine feine Nadel kann verwendet werden, um die Deckgläser vom Boden der Vertiefung zu lösen. Nachdem Sie ein Deckglas auf den Objektträger gelegt haben, drücken Sie es vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, um eventuelle Luftblasen im Eindeckmedium herauszudrücken. Wenn ein Deckglas während des Hebevorgangs gebrochen ist oder möglicherweise umgeklappt ist, montieren Sie es nicht wieder. Verwenden Sie einfach das vierte Ersatzdeckglas.
- Kühlen Sie die Objektträger bis zur Quantifizierung.
>6. Quantifizierung von Infektionen
- Untersuchen Sie DAPI-gefärbte Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie Makrophagen mit einer 100-fachen Objektivlinse mit Immersionsöl fokussieren (Anregung bei 358 nm; optimale Emission bei 461 nm).
Achten Sie darauf, dass der Fokus auf der Schicht der Makrophagen zwischen Objektträger und Deckglas liegt.
- Quantifizieren Sie die Anzahl der Makrophagen (große Kerne, die mit DAPI gefärbt wurden) und die Anzahl kleinerer Amastigotenkerne, die um jeden Makrophagenkern gruppiert sind (siehe Abbildung 1A, DAPI) für jedes Gesichtsfeld mit einem manuellen Zähler.
Anmerkung: Amastigotenkerne sind aufgrund ihrer geringen Größe möglicherweise nicht alle in einer Fokusebene sichtbar. Zählen Sie diejenigen, die sichtbar sind, wenn sie auf Makrophagenkerne fokussiert werden, und verwenden Sie dann die Feinfokussierung, um in den Ebenen über und unter den Makrophagenkernen nach Parasitenkernen zu suchen.
- Wechseln Sie in ein anderes Sichtfeld, um die Quantifizierung zu wiederholen. Verwenden Sie einen separaten Zählerschlüssel, um die Anzahl der gezählten Felder nachzuverfolgen. Bewegen Sie sich in parallelen Reihen über jedes Deckglas durch die Gesichtsfelder, um Zählüberlappungen zu vermeiden.
- Quantifizieren Sie mindestens 200 Makrophagen pro Deckglas. Quantifizieren Sie jeden Zeitpunkt der Infektion in dreifacher Ausfertigung (3 Deckgläser). Zählen Sie das vierte Deckglas, wenn eines der vorherigen aufgrund von Deckglasüberlappung, schlechter Montage, Glasbruch usw. nicht zum Zählen geeignet ist
Anmerkung: Wenn 200 Makrophagen auf keinem Deckglas gezählt werden können, zähle den vierten Ersatz.
- Berechnen Sie die Infektionsraten als Amastigoten/Makrophagen oder Amastigoten/100 Makrophagen und bestimmen Sie den Prozentsatz der infizierten Makrophagen aus den Rohquantifizierungsdaten.
