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>1. Passage von Organoidkulturen
- Geben Sie 1 ml kaltes Basalmedium in die Basalmatrix in der Vertiefung. Pipettieren Sie mit einer 1-ml-Mikropipette kräftig auf und ab, bis die Grundstoffmatrix aufgebrochen ist. In ein 15-ml-Röhrchen umfüllen. Auf Eis legen.
- Nehmen Sie Organoide in der Pipette auf und pipettieren Sie kräftig 10x auf und ab. Das Brechen der Organoide kann mit dem Auge beobachtet werden.
>2. Mikroinjektion von Organoidkulturen.
Hinweis: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien in Organoide zu mikroinjizieren. Es kann hilfreich sein, die Injektion mit Organoiden zu beginnen, die für Mikroinjektionen durchlässiger sind. Zum Beispiel können Magenorganoide von Mäusen zu sehr großen zystischen Organoiden heranwachsen, die leicht zu bekämpfen sind.
- Vorbereitung des Materials
- Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einem Mikropipettenabzieher in zwei Injektionsnadeln, gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Der Mikropipettenabzieher erhitzt die Glaskapillare in der Mitte und zieht die Kapillare in zwei Teile, wodurch zwei Glasnadeln erzeugt werden. Praktisch ist es, mehrere Nadeln zu ziehen und in einer sauberen Petrischale aufzubewahren.
- Um eine bakterielle Infektion zu ermöglichen, entfernen Sie die Antibiotika von allen Medien für mindestens 3 Medienwechsel (= eine Woche). Dadurch werden Antibiotika aus der Grundstoffmatrix verdünnt. Wenn Sie einen Bakterienstamm verwenden, der gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent ist, fügen Sie dieses spezielle Antibiotikum hinzu, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
- Bereiten Sie die Werkbank für Mikroinjektionen vor. Für Arbeiten auf unterschiedlichen Biosicherheitsstufen kann es erforderlich sein, ein Stereomikroskop in einer sterilen Bank zu platzieren. In diesem Protokoll ist H. pylori unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 unter einem Stereomikroskop in einer sterilen Bank zu injizieren.
- Kultivieren Sie die Bakterien nach Standardprotokollen.
- Um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu schätzen, schätzen Sie zwei Parameter: Die Anzahl der Bakterien und die Anzahl der Zellen pro Organoid, wie unten beschrieben. Das MOI kann mit Ergebnissen korrelieren, zum Beispiel mit der IL-8-mRNA-Expression des Wirts.
- Um die Bakteriendichte in der Infektionslösung zu berechnen, wird zunächst die Standardkurve der optischen Dichte und der koloniebildenden Einheiten (KBE) gemäß Standardprotokollen festgelegt. Eine optische Dichte von 0,1 bei 550 nm sollte etwa 107 KBE/ml ergeben.
- Um die Anzahl der Zellen pro Organoid zu schätzen, zählen Sie die Anzahl der Organoide in 1 Vertiefung. Zerlegen Sie Organoide wie in den Schritten 1.1 bis 1.4 beschrieben. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 200 x g und 4 °C wird 1 ml enzymatische Dissoziationslösung zugegeben und resuspendiert.
- Inkubieren bei 37 °C mit wiederholtem Schütteln für 5-10 Minuten. Bestimmen Sie, ob die Zellen unter dem Mikroskop (inverses Mikroskop wie Leica DMIL bei 10-facher Vergrößerung) in einzelne Zellen dissoziiert sind. Verlängern Sie gegebenenfalls die Inkubation.
- Zählen Sie Zellen pro Organoid mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Organoid. Humane Magenorganoide mit einem Durchmesser von etwa 200 μm haben etwa 4.000 Zellen. Die Injektion von 0,2 μl einer bakteriellen Lösung mit 1 x 109 Bakterien pro ml ergibt ein ungefähres Trägheitsmoment von 50.
- Injektion von Organoiden.
Hinweis: Bei der Mikroinjektion wird die Glasnadel in einer Halterung stabilisiert, die durch einen Mikromanipulator in 3 Dimensionen manövriert werden kann. Organoide verbleiben in der Grundstoffmatrix innerhalb der Vertiefung. Aufgrund der Größe und Positionierung in der Vertiefung sind nicht alle Organoide gleichermaßen für die Injektion geeignet. In der Regel können die 30 größten Organoide in einer Vertiefung in 5 Minuten anvisiert werden.
- Ernten Sie Bakterien und waschen Sie sie im Basalmedium gemäß den Standardprotokollen.
- Berechnen Sie die Anzahl der Bakterien pro ml entsprechend der optischen Dichte (siehe Schritt 2.1.5.1). Verdünnen Sie die Bakterien auf 1 x 109 Bakterien pro ml in einem Basalmedium.
- Nimm eine Glasnadel. Brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette auf, so dass die Öffnung ca. 10 μm breit ist.
- Führen Sie die Nadel in den Injektionshalter ein und befestigen Sie sie am Mikromanipulator.
- Nehmen Sie ca. 10 μl Bakterienlösung in die Nadel auf.
- Legen Sie eine 4-Well-Platte mit niedrigen Rändern mit Organoidkulturen unter das Stereomikroskop.
- Navigieren Sie mit dem Mikromanipulator und zielen Sie mit der Nadel auf ein einzelnes Organoid. Positionieren Sie die Nadel nahe am Organoid und führen Sie die Nadel dann mit einer schnellen Bewegung in das Organoid ein. Injizieren Sie mit dem Mikroinjektor ca. 0,2 μl Bakterienlösung in jedes Organoid.
3. Organoide für jede Analyse ernten.
- Organoide werden z. B. nach 4 Stunden fixiert. Überstand entfernen und 1 ml 2 % Formaldehyd hinzufügen und 20 Minuten bei RT oder O/N bei 4 °C inkubieren. Organoide können für die Immunhistochemie nach Standardverfahren verarbeitet werden.