>1. Generierung einer Bibliothek von grün fluoreszierenden Proteinen, GFP-markierten Coxiella-Transposon-Mutanten
Manipulation von Coxiella burnetii RSA439 NMII in einem Biosicherheits-Containment Level 2 (BSL-2) in einer mikrobiellen Sicherheitswerkbank (MSC) in Übereinstimmung mit den lokalen Vorschriften. Wenn dies mit dem verwendeten Bakterienmodell vereinbar ist, wiederholen Sie die Schritte von 1.4.1 bis 1.4.4, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, klonale Mutanten zu erhalten. Eine typische Mutantenbibliothek besteht (mindestens) aus einer Anzahl von Mutanten, die der dreifachen Anzahl der kodierenden Sequenzen entspricht, die im Genom des verwendeten Organismus annotiert sind.
- Zubereitung von elektrokompetentem Coxiella RSA439 NMII:
- Bereiten Sie 1x angesäuertes Citrat Cystein-Medium-2 (ACCM-2) vor: 13,4 mM Zitronensäure, 16,1 mM Natriumcitrat, 3,67 mM Kaliumphosphat, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,02 mM Calciumchlorid, 0,01 mM Eisensulfat, 125,4 mM Natriumchlorid, 1,5 mM L-Cystein, 0,1 g/L Bacto Neopepton, 2,5 g/L Casaminosäuren, 1 g/L Methyl-Beta-Cyclodextrin, 125 ml/L Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Stellen Sie den pH-Wert auf 4,75 ein und sterilisieren Sie den Filter (nicht autoklavieren).
Anmerkung: Flüssiges ACCM-2 ist bei 4 °C für ca. 1 Monat stabil.
- 100 ml ACCM-2 werden mit 2 x 106 Genomäquivalent (GE)/ml Coxiella RSA439 NMII (aus einem zuvor gemäß Schritt 1.5 erzeugten und quantifizierten Bakterienstamm) aus -80 °C-Beständen inokuliert und die Bakteriensuspension in 75 cm großen 2-Zellkulturkolben mit belüfteten Kappen (10 - 15 ml Bakteriensuspension pro Kolben) verteilt. Anbau für 7 Tage bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid (CO2) und 2,5 % Sauerstoff (O2).
- Die resultierende Bakteriensuspension in 50-ml-Röhrchen poolen und bei 3.900 x g für 1 Stunde bei 4 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 30 ml 10%igem Glycerin. Zentrifugieren Sie bei 3.900 x g für 1 Stunde bei 4 °C.
- Das Pellet wird in einem ausreichenden Volumen von 10 % Glycerin (typischerweise 2 ml) resuspendiert und 50 μl in 500 μl Röhrchen aliquotiert. Halten Sie die resuspendierten Bakterien während des gesamten Prozesses auf Eis.
Anmerkung: In diesem Stadium sind Bakterien elektrokompetent und ein Aliquot reicht aus, um eine Elektroporation durchzuführen. Die bakteriellen Suspensionen können 6 Monate bei -80 °C gelagert oder direkt für die Elektroporation von Plasmid-Desoxyribonukleinsäure (DNA) verwendet werden.
- Elektroporation von kompetenten Coxiella mit Transposon- und Transposase-kodierenden Plasmiden:
- Eine 0,1 cm Elektroporationsküvette 10 min auf Eis vorkühlen. 50 μl elektrokompetentes Coxiella mit 10 μg Transposon-Plasmid und 10 μg Transposase-Plasmid mischen. Stellen Sie sicher, dass die Plasmidkonzentration höher als 500 μg/ml ist, um die Verdünnung des Glycerins zu minimieren.
- Elektroporate mit folgendem Aufbau: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Zeitkonstante zwischen 9 und 13 ms liegt.
- Sofort 950 μl RPMI zugeben, die elektroporierten Bakterien resuspendieren und in ein Schraubverschlussröhrchen umfüllen und bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Nehmen Sie 200 μl der elektroporierten Bakterien und geben Sie 3 ml ACCM-2, ergänzt mit 1 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), in 6-Well-Platten. 88 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) zum verbleibenden Volumen der elektroporierten Bakterien geben (um eine Endkonzentration von 10 % DMSO zu erreichen) und bei -80 °C lagern.
HINWEIS: Für das folgende Protokoll werden das transponierbare Element und die Transposase durch zwei verschiedene Plasmide (pITR-CAT-GFP bzw. pUC19-Himar1C9) kodiert. Beiden Plasmiden fehlt ein Coxiella-spezifischer Replikationsursprung, so dass sie Selbstmordplasmide sind, wenn sie in Coxiella elektroporiert werden. Dies gewährleistet stabile Transposon-Insertionen. Das transponierbare Element enthält eine Chloramphenicol-Resistenzkassette unter der Regulation des Coxiella-Promotors p1169 zur Selektion und das gfp-Gen unter der Regulation des Coxiella-Promotors p311, um die erzeugten Mutanten mit GFP zu markieren.
- Auswahl der Transposon-Mutanten:
- Die wie oben (1.2.4) inokulierten 6-Well-Platten werden über Nacht bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 und 2,5 % O2 inkubiert. Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika (375 μg/ml Kanamycin oder 3 μg/ml Chloramphenicol) hinzu. Inkubieren Sie die Bakterienkultur für weitere 3 Tage unter den oben beschriebenen Bedingungen.
- Isolierung einzelner Mutanten:
- Präparation von festen ACCM-2-Platten und Plattierung von Coxiella-Transposon-Mutanten
Anmerkung: Die folgende Anleitung gilt für 1 Petrischale, mehrere Verdünnungen von Bakterienkulturen müssen getestet werden, um das optimale Impfvolumen für die Kolonieisolierung zu bestimmen.
- 10,5 ml 0,5 % Agarose in der Mikrowelle erhitzen und im 55 °C warmen Wasserbad abkühlen lassen. 11.25 ml 2x ACCM-2 (pH 4.75) auf 37 °C erhitzen.
- Untere Agarose zubereiten:
- Mischen Sie 10 ml geschmolzene 0,5%ige Agarose mit 10 ml 2x ACCM-2 und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika (375 μg/ml Kanamycin oder 3 μg/ml Chloramphenicol) hinzu.
- Sofort in die Petrischale gießen. Lassen Sie die Petrischale unverschlossen, lassen Sie das Medium 30 Minuten abkühlen und 20 Minuten an der Luft trocknen.
- Top-Agarose zubereiten:
- 1,25 ml 2x ACCM-2 mit 0,75 ml Wasser in ein 5 ml Polystyrolröhrchen geben, die entsprechenden Antibiotika (375 μg/ml Kanamycin oder 3 μg/ml Chloramphenicol) zugeben und bei 37 °C inkubieren.
- Die Bakterienkultur (typischerweise 1 bis 100 μl) hinzufügen und 5 Sekunden lang vortexen.
- 0,5 ml geschmolzene Agarose hinzufügen, mischen und sofort auf die untere Agarose gießen.
- 20 min abkühlen lassen, den Deckel wieder auf die Petrischale setzen und 20 min bei 4 °C inkubieren, um die Agaroseverfestigung zu erleichtern.
- 20 Minuten lang an der Luft trocknen lassen, ohne Deckel in einem MSC. Wachsen Sie die Platten bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 und 2,5 % O2 für 6 bis 7 Tage.
- Geben Sie DMSO zu den restlichen Bakterienkulturen, um eine Endkonzentration von 10 % DMSO zu erreichen, und lagern Sie es bei -80 °C.
- Beurteilen Sie die optimale Verdünnung wie folgt: Stellen Sie sicher, dass die Kolonien einen Durchmesser von 0,5 bis 1 mm haben und ordnungsgemäß isoliert sind, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die verbleibenden Bakterienkulturen aus Nummer 1.4.2 auftauen und in geeigneter Verdünnung auf ACCM-2-Agar auftauen, wie in den Abschnitten 1.4.1.2 und 1.4.1.3 beschrieben. 6 bis 7 Tage inkubieren, wie in 1.4.1.3.5 beschrieben.
- Sobald Kolonien nachweisbar sind, sammeln Sie sie, indem Sie das Ende einer 1-ml-Spitze abschneiden, den Pfropfen mit den isolierten Kolonien aufnehmen und die Kolonie dispergieren, indem Sie 1,5 ml ACCM-2 mit den entsprechenden Antibiotika (375 μg/ml Kanamycin oder 3 μg/ml Chloramphenicol) in eine 24-Well-Platte pipettieren. Einzelne Völker werden 6 Tage lang unter den in Abschnitt 1.3.1 beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Am Tag 3 der Inkubation verteilen Sie die Bakterienklumpen, indem Sie jede Kultur pipettieren.
- Lagern Sie jede mutierte Suspension in 2D-Schraubverschlussröhrchen mit Barcode in 96-Well-Platten mit 10 % DMSO bei -80 °C.
- Bewertung der Bakterienkonzentration:
Anmerkung: Das folgende Protokoll kann angewendet werden, um die Wachstumskurven von bakteriellen Mutanten zu erhalten, die sich in einem axenischen Medium replizieren (siehe 1.4.4).
- Standard-Kurvenvorbereitung:
- Bereiten Sie eine 2 μg/ml Stammlösung aus doppelsträngiger DNA (dsDNA) (typischerweise ein zufälliges Plasmid bekannter Größe und Konzentration) in 1x Tris-Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA (TE) vor. Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen aus der Stammlösung vor, um Konzentrationen von 2 μg/ml bis 2 ng/ml zu erhalten. Geben Sie 50 μl jeder Konzentration in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und schwarzem Boden (siehe Tabelle Materialien).
- Verdünnen Sie das dsDNA-Quantifizierungsreagenz 1:200 in 1x TE-Puffer und geben Sie 55 μl des verdünnten Reagenzes zu jeder Probe in der 96-Well-Mikroplatte. Mit einem Plattenschüttler gut mischen und 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Messen Sie die Fluoreszenz der Proben mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und Filtern für Standard-Fluoreszein-Wellenlängen (Anregung ~480 nm, Emission ~520 nm).
- Plotten Sie den Plasmidkonzentrationsbereich gegen die Messwerte der Fluoreszenzintensität.
- Quantifizierung der bakteriellen Suspension:
- Geben Sie 5 μl 10 % Triton X-100 pro Well in eine 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und schwarzem Boden ab (siehe Materialtabelle). 50 μl der Bakteriensuspensionen in jede Vertiefung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubieren.
- Verdünnen Sie das dsDNA-Quantifizierungsreagenz 1:200 in 1x TE-Puffer und geben Sie 55 μl des verdünnten Reagenzes zu jeder Probe in der 96-Well-Mikroplatte. Mit einem Plattenschüttler gut mischen und 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Messen Sie die Fluoreszenz der Proben mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und Filtern für Standard-Fluoreszein-Wellenlängen (Anregung ~480 nm, Emission ~520 nm).
- Um die bakterielle DNA-Konzentration zu ermitteln, sind die Fluoreszenzmesswerte in der Tabelle unter Nummer 1.5.1.4 darzustellen. Die DNA-Konzentration wird durch die Masse des Coxiella-Genoms (2,2 fg) dividiert, um die Bakterienkonzentrationen zu erhalten. Geben Sie die Ergebnisse in Genomäquivalent/ml aus.
- Mutanten, die einen signifikanten Wachstumsdefekt in ACCM-2 aufweisen, werden verworfen.
2. Einzelprimer-Kolonie-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sequenzierung und Annotation
HINWEIS: Das folgende Protokoll gilt für die DNA-Amplifikation von 96 Proben, eine Mehrkanalpipette wird für die folgenden Schritte empfohlen. Die Säulenaufreinigung von PCR-Produkten mit magnetischen Beads und die DNA-Sequenzierung mit einem transposonspezifischen Primer (2.3) wird an ein externes Unternehmen vergeben.
- Stellen Sie sicher, dass der Amplifikationsprimer so konzipiert ist, dass er zwischen 100 und 200 Basenpaare stromaufwärts des invertierten Tandemrepeats (ITR) hybridisiert, um PCR-Produkte zu erhalten, die die Transposon-Insertionsstelle im Coxiella-Genom abdecken. Bereiten Sie 3 ml PCR-Mix vor (1x High-Fidelity-Puffer, 200 μM Desoxynukleosidtriphosphat (dNTPs), 1 μM Amplifikationsprimer, 20 U/ml High-Fidelity-DNA-Polymerase) und dosieren Sie 29 μl pro Well in eine 96-Well-PCR-Platte, die auf Eis gestellt ist. Übertragen Sie 1 μl jeder Mutante in der stationären Phase in ACCM-2 in den PCR-Mix.
- PCR mit initialer Denaturierung (98 °C, 1 min), 20 Zyklen mit hoher Stringenz (98 °C, 10 Sekunden; 50 °C, 30 Sekunden; 72 °C, 90 Sekunden), 30 Zyklen mit niedriger Stringenz (98 °C, 10 Sekunden; 30 °C, 30 Sekunden; 72 °C, 90 Sekunden) und 30 Zyklen mit hoher Stringenz (98 °C, 10 Sek.; 50 °C, 30 Sek.; 72 °C, 90 sec), gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 7 min.
- Aufreinigen Sie PCR-Produkte mit magnetischen Beads und sequenzieren Sie DNA mit einem transposonspezifischen Primer. Entwerfen Sie den transposonspezifischen Primer mit einer vorhergesagten Schmelztemperatur zwischen 50 °C und 75 °C, einem GC-Gehalt zwischen 40 % und 60 %, einer Länge zwischen 18 und 25 Nukleotiden und einer Annealing-Stelle stromabwärts der Amplifikations-Primer-Hybridisierungsstelle und mindestens 100 Basenpaaren stromaufwärts des ersten Basenpaares des Transposons ITR.
- Laden Sie mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware das vollständige, annotierte Genom von Coxiella burnetii 493 NMI. Verwenden Sie die Funktion "Align to Reference", um die Sequenzierungsergebnisse zu laden und auszurichten (zu strahlen) und den Ort der Transposition zu bestimmen. Verwerfen Sie Mutanten mit nicht übereinstimmenden und/oder doppelt gelesenen Reads. Um die Sättigung der Mutantenbibliothek zu überwachen, führen Sie Aufzeichnungen über das Auftreten mehrerer Transposon-Insertionen an derselben Stelle.
>3. Eukaryotische Zellen Herausforderung mit Coxiella-Mutanten und Überwachung des intrazellulären Wachstums
HINWEIS: Für die folgenden Schritte wird eine Mehrkanalpipette empfohlen. Die Infektionen wurden in dreifacher Ausfertigung in sterilen 96-Well-Mikrotiterplatten mit schwarzen Wänden und flachen, transparenten Böden durchgeführt. wt Coxiella burnetii, das GFP exprimiert, wurde von Dr. Robert Heinzen zur Verfügung gestellt.
- Züchten Sie Vero-Zellen in RPMI ohne Phenolrot, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in Abwesenheit von Antibiotika (Complete RPMI media).
- Waschen Sie Vero-Zellen am Tag vor der Infektion aus einem konfluenten oder subkonfluenten Zellkulturkolben mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Vero-Zellen werden durch Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung in den Zellkulturkolben abgenommen und 3 bis 5 Minuten bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 inkubiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml Complete RPMI-Medien. Zellen werden gezählt und eine Zellsuspension von 105 Zellen pro ml hergestellt.
- Geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem, transparentem Boden.
5 - min bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, um die Zelladhäsion am Boden der Vertiefungen zu erleichtern, und über Nacht bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren.
- Tauen Sie die 96-Well-Platten mit den Coxiella-Mutanten bei RT auf und verdünnen Sie 150 μl Bakteriensuspension in 300 μl RPMI ohne Phenolrot und FBS in einer 96-Well-Deep-Well-Platte.
- Entfernen Sie das Medium aus der Mikroplatte mit Vero-Zellen und geben Sie 100 μl/Vertiefung verdünnte Coxiella-Mutanten ab (MOI von 100). Die Vertiefung A1 als negative Kontrolle (nicht infizierte Zellen) und die Vertiefungen A2 und A3 als Positivkontrollen (mit wt Coxiella infizierte Zellen, die GFP bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 100 und 200 exprimieren).
- Zentrifugieren Sie die Platte 10 min lang bei 400 x g bei RT mit einem aerosoldichten Zentrifugenplattenhalter.
- Bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 2 für 2 Stunden inkubieren, dann das bakterienhaltige Medium durch 100 μl/Vertiefung frisches, vollständiges RPMI-Medium ersetzen.
- Messen Sie die GFP-Fluoreszenz täglich für 7 Tage mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und Filtern für Standard-Fluoreszein-Wellenlängen (Anregung ~480 nm, Emission ~520 nm). Um Interferenzen durch Kondensation und Signaldispersion im Kulturmedium zu vermeiden, verwenden Sie die Aufzeichnung der Bodenanregung und -emission auf dem Mikroplatten-Reader.
>4. Vorbereitung von Proben für die automatisierte Bildaufnahme
HINWEIS: Das Verfahren gilt für eine 96-Well-Platte, skalieren Sie die Volumina entsprechend hoch. Die Schritte ab 4.2 können die Vorteile einer Tellerwaschmaschine nutzen.
- Am 7. Tag nach der Infektion nehmen Sie das Medium von der Platte und ersetzen Sie es durch 50 μl/Vertiefung frisches, vollständiges Medium, das einen zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff in der entsprechenden Verdünnung enthält (in der Regel 1:1.000, je nach verwendeter Zelllinie zu optimieren). Inkubieren Sie die Zellen 30 - 60 min bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2
.
- Ersetzen Sie das Medium durch 50 μl/Vertiefung mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS, inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), entfernen Sie dann den PFA-haltigen Puffer und waschen Sie es 3 Mal mit PBS.
- Entfernen Sie PBS und geben Sie 50 μl/Vertiefung Blockierungslösung (0,5 % Rinderserumalbumin, 50 mM Ammoniumchlorid, NH4Cl in PBS, pH 7,4) ab, ergänzt mit 0,05 % Saponin. 30 Minuten bei RT inkubieren.
- Ersetzen Sie die Blockierungslösung durch 40 μl/Vertiefung frischer Blockierungslösung, die mit Saponin (wie oben) und mit einem Anti-Lysosom-assoziierten Membranglykoprotein-1 (Anti-LAMP1)-Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 ergänzt wird. Die Platte 30 min bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung und waschen Sie die 96-Well-Platte 5 Mal mit 100 μl/Well PBS.
- 40 μl/Vertiefung Blockierungslösung, zugegeben mit Saponin (wie oben), dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (in einer Verdünnung von 1:1.000), um den in Schritt 4.4 aufgetragenen Anti-LAMP1-Antikörper freizulegen, und mit Hoechst 33258 in 5 μg/ml. Die Platte 30 Minuten lang bei RT inkubieren.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung und waschen Sie die 96-Well-Platte 5 Mal mit 100 μl/Well PBS. Lassen Sie das PBS-Volumen, das der letzten Wäsche entspricht, in der 96-Well-Platte, da die fixierten Zellen nicht austrocknen sollten.
- Bilden Sie die Platte sofort ab oder lagern Sie die Platte für die spätere Analyse bei 4 °C lichtgeschützt.
>5. Bilderfassung
- Erfassen Sie Bilder in den Kanälen GFP (488 nm, Bakterien), Hoechst 33258 (350 nm, Zellkerne der Wirtszelle), rot (~555 nm, Zellmembranmarker) und fernrot (~615 nm, LAMP1) mit einem automatisierten Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv ausgestattet ist. Erfassen Sie 21 unabhängige Felder pro Well, um mindestens 5.000 Zellen pro Probe abzubilden. Wenden Sie den Autofokus an, indem Sie den Kernkanal der Wirtszelle als Referenz verwenden. Bei der Arbeit mit bakteriellen Krankheitserregern, die einen geringen Prozentsatz der Wirtszellen infizieren, können Benutzer die Anzahl der unabhängigen Felder, die pro Vertiefung abgebildet werden, anpassen, um mindestens 500 infizierte Zellen für die Analyse zu erhalten.
