Die folgenden Protokolle beschreiben Methoden zur Kultivierung und Untersuchung der Invasion durch die anaerobe Spezies P. gingivalis; diese Protokolle können jedoch für eine Reihe von anaeroben Krankheitserregern verwendet werden. Obwohl HUVECs verwendet werden, kann dieses Protokoll auch für andere eukaryotische Zellen verwendet werden, sowohl immun als auch nicht-immun.
>1. Verwendung und Wartung der anaeroben Kammer
Hinweis: P. gingivalis ist ein Anaerobier, der empfindlich auf normale Sauerstoffmengen in der Umgebungsluft reagiert. Ein kontrolliertes anaerobes Milieu ist für die Kultivierung von P. gingivalis von entscheidender Bedeutung.
- Hier wird eine künstliche Atmosphäre, die als anaerobes Mischgas (80 % N2, 10 % H2, 10 % CO2) bezeichnet wird, in einer anaeroben Vinylkammer aufrechterhalten (Abbildung 1A). Verwenden Sie eine Schleuse (Abbildung 1B), um Gegenstände aus der Laborumgebung in die anaerobe Kammer zu befördern. Die Schleuse arbeitet manuell und spült zweimal mit N2 -Gas, bevor das anaerobe Mischgas eingeleitet wird.
- Verwenden Sie eine Schwefelwasserstoffentfernungssäule (Abbildung 1C) zur wartungsfreien Entfernung des unerwünschten Schwefelwasserstoffs. Stellen Sie einen Luftentfeuchter in die Kammer, um das vom Katalysator erzeugte H2O zu entfernen und Aerosole zu vermeiden, die die Ausbreitung von Verunreinigungen begünstigen.
Anmerkung: Schwefelwasserstoff ist ein natürliches Stoffwechselnebenprodukt vieler anaerober Bakterien, und seine Anreicherung ist giftig für Bakterien und kann zu Schäden an der Elektronik führen und die Lebensdauer eines Katalysators verkürzen.
- Verwenden Sie eine Lüfterbox, um die Atmosphäre der Kammer durch einen Palladiumkatalysator zu zirkulieren, der in Gegenwart von Wasserstoff Sauerstoff entfernt (Abbildung 1D).
Beachte: Ein atmosphärischer Umluftfilter (hocheffiziente Partikelluft oder HEPA) entfernt Verunreinigungen in der Luft mit einer Größe von 0,22 μm oder größer.
- Kultivieren Sie anaerobe Bakterien in einem 37 °C heißen Inkubator, der sich in der anaeroben Kammer befindet. Verwenden Sie standardmäßige aseptische Techniken, wenn Sie in der anaeroben Kammer arbeiten.
>2. Präparation anaerober Bakterien
Hinweis: P. gingivalis ist aerotolerant und kann unter aeroben Bedingungen gelagert werden, aber es wächst nicht in Gegenwart von Sauerstoff bei einem Gehalt von mehr als 6%. Eine anaerobe Kammer ist für die korrekte Kultivierung von P. gingivalis und anderen anaeroben Spezies notwendig (Abbildung 1). Vor der Arbeit mit Mikroanaerobiern ist eine angemessene Schulung und Schulung in der Verwendung der anaeroben Kammer erforderlich.
- Alle flüssigen Medien und Platten werden vor dem Versuch mindestens 12 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen äquilibriert, um den Restsauerstoff zu entfernen.
- P. gingivalis aus dem -80 °C warmen Gefrierschrank in eine anaerobe Kammer geben und auftauen lassen.
- Streifen P. gingivalis auf Trypticase-Sojablut-Agarplatten (TSA II mit 5% Schafsblut). Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und lagern Sie sie bei 37 °C in einem anaeroben Inkubator für 4-7 Tage.
- P. gingivalis wird in 3 ml Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) geimpft, die mit Hemin und Menadion, einem angereicherten nicht-selektiven flüssigen Medium für die Isolierung und Kultivierung von anaeroben und anspruchsvollen Mikroorganismen, unter Verwendung steriler Schleifen ergänzt wird.
Anmerkung: Für die Langzeitlagerung in BHI hergestellte Bakterienkulturen mit Glycerin oder DMSO (10-20 % Endkonzentration) mischen und in einen -80 °C-Gefrierschrank stellen.
- Bereiten Sie eine Starterkultur von P. gingivalis vor, indem Sie eine Verdünnung von 1:10 vornehmen und die Bakterien bis zur Mitte der logarithmischen Phase wachsen lassen.
Hinweis: Die optische Dichte der Bakteriensuspension wird bestimmt und die Bakterienkonzentration für jeden zu untersuchenden Stamm angepasst. Für P. gingivalis entspricht eine Suspension bei OD660 von 0,7 der Mid-Log-Phase und ~7 x 108 Zellen/ml. Die im obigen Protokoll beschriebenen Wachstumsbedingungen sind spezifisch für P. gingivalis und müssen möglicherweise an andere Bakterienstämme angepasst werden.
>3. Endothelzellkultur
Hinweis: Kaufen Sie gepoolte primäre HUVECs und Kultur in Basalmedium, das vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGF) bei 37 °C in 5% CO2 enthält, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Saatgut-HUVECs in T-75-Kolben mit 2,5 x 105 Zellen/Kolben in 15 ml VEGF-Medien.
Anmerkung: Prüfung der Lebensfähigkeit durch eine 1:1-Verdünnung mit 4,0 % Trypanblau. Zellen mit einer kompromittierten Membran behalten Trypanblau bei, und gesunde Zellen mit intakten Membranen erscheinen weiß, wenn sie unter einem binokularen Lichtmikroskop betrachtet werden. Zählen Sie 100 Zellen und stellen Sie sicher, dass über 80 % der Zellen lebensfähig sind.
- Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage durch vorgewärmte, frische VEGF-Medien, bis die Zellen eine Konfluenz von ~80 % erreichen.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Befreien Sie die Zellen aus dem T75-Kolben, indem Sie 5 Minuten lang mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25 %) inkubieren, gefolgt von 2 ml Trypsin-neutralisierender Lösung.
- Suspendierte HUVECs werden in einem konischen 50-ml-Röhrchen gesammelt. Alle überschüssigen Zellen aus den T-75-Kolben mit PBS auswaschen und in konische 50-ml-Röhrchen umfüllen.
- Zellen bei 200 x g für 10 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml vorgewärmtem VEGF-Medium.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer oder einem ähnlichen Zellzählgerät.
- Berechnen Sie die Menge an Zellsuspension, die entweder zu einer 6-Well-Platte (400.000/Well) oder einer 12-Well-Platte mit Deckgläsern (50.000/Well) hinzugefügt werden soll. Die HUVECs werden am nächsten Tag für Experimente bereit sein.
>4. Invasion/Interaktion mit Überlebensassays (Plattierung)
Hinweis: Bereiten Sie bei der Durchführung dieses Assays zwei 6-Well-Platten mit Endothelzellen vor, die mit 400.000 Zellen/Well ausgesät werden. Eine Platte wird verwendet, um Bakterien zu bewerten, die an Wirtszellen gebunden sind und von diesen internalisiert werden. Die andere Platte wird intrazelluläre Bakterien berücksichtigen. Die 6-Well-Platte ermöglicht die Durchführung von Triplikaten von zwei Proben in einem Experiment. Einen Überblick über dieses Protokoll finden Sie im Flussdiagramm des Survival-Assays (Abbildung 2).
- Bereiten Sie anaerobe Bakterien wie oben beschrieben vor (siehe Abschnitt 1), bis sie das mittlere logarithmische Wachstum erreichen (OD660 0,5-0,7).
- Bakterien bei 5.000 x g für 10 min.
zentrifugieren
Hinweis: Wenn sich die Zentrifuge außerhalb einer anaeroben Kammer befindet, tragen Sie Bakterienproben in einem dicht verschlossenen 15-ml-Röhrchen und umwickeln Sie die Kappe mit Parafilm, um ein Austreten von Sauerstoff zu verhindern.
- Setzen Sie pelletiertes P. gingivalis wieder in die Kammer ein und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie es mit PBS und pelletieren Sie die Bakterien erneut, bevor Sie es in VEGF-Medien resuspendieren. Bereiten Sie Suspensionen für alle zu testenden Bakterienstämme bei OD660 von 0,7 vor, was der Mid-Log-Phase (~7 x 10,8 Zellen/ml) entspricht. Die Bakterien sind nun bereit für eine Infektion.
- Übertragen Sie 6-Well-Platten mit HUVECs aus dem Gewebekultur-Inkubator in die anaerobe Kammer. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es dreimal mit anaerobem PBS. Geben Sie 2 ml anaerobes VEGF-Medium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platten bei 37 °C für 20 Minuten in den anaeroben Inkubator, um die Temperatur für die Infektion auszugleichen.
Anmerkung: Platten Bakterien auf Blutagarplatten, um sicherzustellen, dass die für die Infektion verwendeten Platten homogen und bei einer Infektion nicht kontaminiert sind.
- Infizieren Sie Wirtszellen mit Bakterien bei einer Infektionsvielfalt (MOI-Bakterien: Wirt) von 100:1,
Anmerkung: Die HUVEC-Zellzahl wird bestimmt, indem vor der Infektion ein Trypan-Ausschlusstest an einer einzelnen Vertiefung durchgeführt wird. Die bakterielle Zellzahl wird über die optische Dichte bestimmt (z.B. OD von 0,5 = 5 x 108 Zellen/ml). Die Bakterienkonzentration wird auf der Grundlage der HUVEC-Konzentration an den richtigen MOI angepasst.
- Legen Sie 6-Well-Platten mit infizierten HUVECs in den anaeroben Inkubator und lassen Sie die Bakterien 30 Minuten lang mit den Wirtszellen interagieren.
- Bereiten Sie Saponin in BHI (1,0 % w/v) in der anaeroben Kammer vor und filtrieren Sie durch einen 0,2 μm Filter.
- Überleben sowohl von anhaftenden als auch von internalisierten Bakterien.
- Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator, saugen Sie das Medium ab, waschen Sie es dreimal mit anaerobem PBS und fügen Sie 2 ml filtriertes 1,0%iges Saponin hinzu (hergestellt wie in Schritt 4.8 beschrieben). 15 Minuten inkubieren, um die Lyse der Wirtszellen zu ermöglichen.
- Kratzen Sie den Boden jeder Vertiefung mit einem Zellschaber ab. Sammeln Sie die Zellmischung aus jeder Vertiefung und verdünnen Sie sie 1:1 in BHI.
- Fahren Sie mit den seriellen Verdünnungen der Probe fort. Abhängig von der Bakterienart und -konzentration sind die seriellen Verdünnungen anzupassen. Beginnen Sie mit Verdünnungen von 1:100 oder 1:1.000
.
- Platte 200 μl der gewünschten Verdünnung auf Blut-Agar-Platten. Wickeln Sie die Platten in Parafilm ein und legen Sie sie in den anaeroben Inkubator bei 37 °C.
- Entfernen Sie nach siebentägiger Inkubation bei 37 °C die Platten und zählen Sie die koloniebildenden Einheiten (KBE) mit einem Leuchtkasten, um die Kolonien manuell zu zählen.
Anmerkung: KBE werden aufgezählt. Bei größeren Mengen von KBE können Bilder aufgenommen werden, und es kann Computersoftware verwendet werden, um die Zählung von KBE zu erleichtern.
